非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳簡述

聚丙烯酰胺凝膠製備 
  4.1 清洗玻璃板、灌膠用量筒和燒杯,玻璃板氣幹(製膠用玻璃板為硫化玻璃,灌膠麵**幹淨無水分,否則灌膠時容易產生氣泡;燒杯、量筒和玻璃板如果有水,由於膠與水不相溶,易使膠不能牢固粘在玻璃板上); 
  4.2將平口玻璃板和凹口玻璃板放在桌麵的支撐物(瓶蓋等)上,給玻璃板滴少量100%乙醇,用質量好的紙均勻擦洗製膠麵,氣幹;  
  4.3 平口玻璃板和凹口玻璃板的三個邊均勻的塗抹適量凡士林(凡士林太多不容易清洗);放上需要厚度的板條,此步應注意密封好板條的相接處,用手將三邊和接茬處按牢固,否則容易漏膠;然後用夾子(夾子夾在板條中間)將玻璃板固定於灌膠架上; 
  4.4 配膠(8%非變性聚丙烯酰胺凝膠,Acr:Bis=37.5:1)、灌膠;  
將以下母液按量混合均勻保存於4℃,一般一周內用完,

製膠及電泳 
(1)膠板的準備:**先確定兩塊玻璃板是否平整,用去汙劑和清水將玻璃板洗滌幹淨,並用蒸餾水衝洗,晾幹後用95%乙醇擦拭。 
1 用1~2 ml 95%的乙醇依次將長玻璃和短玻璃的正麵擦拭幹淨、均勻;(以平整、光滑的一麵為正麵)(**次用的玻璃板**好擦2~3次) 
2 用加樣槍取1ml配置好的親和矽烷均勻分布於長玻璃的正麵,用紗布塗抹均勻;(**次用的玻璃板**好用親和矽烷擦2~3次) 
3 用加樣槍取0.5~1ml配置好的剝離矽烷均勻分布於長玻璃的正麵,用紗布塗抹均勻;(擦**感覺特別光滑為止) 
4 用1ml 95%的乙醇依次將長玻璃和短玻璃的正麵擦拭均勻;(可使親和矽烷和剝離矽烷分布更未均勻,也可擦去多餘部分) 
5 檢查玻璃板正麵有誤紗布絨毛之類的異物,若有,可吹走;取0.4mm的邊條,用紗布擦淨,置於長玻璃板的左右兩側,靠邊放置,將短玻璃板壓於長玻璃板上,調整邊條和短玻璃板的位置,使邊條剛好處於邊緣位置,但不突出,且長短玻璃板剛好對其,用夾子固定住玻璃板的兩側;以1×TAE配製1%瓊脂糖凝膠並封住玻璃板底部,待凝膠凝固後用醫用膠帶密封;將玻璃板凹槽向上小角度傾斜放置,準備灌膠。 
(2)製膠:稱取尿素21g,加入17ml雙蒸水加熱約二三十秒溶解,待冷卻後加入10ml 5×TBE,冰浴**冰手時加入7.5ml 40%丙烯酰胺(19:1),然後加入225μl 10%過硫酸銨和50μl TEMED,快速混勻,準備灌膠。 
(3)灌膠:用5ml加樣槍將製備好的膠液沿玻璃板中部緩慢加入到膠板玻璃板之間的空隙,注意不能在膠中形成氣泡(要多次實驗以掌握技巧、控製加樣速度、調節玻璃板傾斜度、手按、豎起玻璃板、便輕敲變加樣等)。膠灌滿後,將鯊魚齒的平端插入膠液下5mm左右(不可過深,以免後麵不能加樣;也不可過淺,以免上樣量過小),同時防止梳齒平端下方出現氣泡,於室溫下靜置2h,使膠完全聚合後使用。 
(4)預電泳:撕去膠布,兩端平行用力拔出梳齒,將玻璃板和梳齒上的多餘凝膠擦洗幹淨,用蒸餾水漂洗玻璃板、梳子。將玻璃板裝到電泳槽上,在下方電泳槽中加入1×TBE**沒過玻璃板下端約1cm,裝好電泳槽,加入1×TBE**沒過玻璃板上端約1.5cm處,用梳齒刮去玻璃板間隙間的碎膠,再用5ml加樣槍將其吹幹淨,反轉梳齒,將鯊魚齒插入凝膠膠麵下約0.5mm,並用夾子夾緊,梳齒間空隙即為加樣孔。120w恒功率,預電泳30min。 
(5)點樣:點樣前用加樣槍吹吸每個上樣槽,將梳齒間隙間油狀液體吸幹淨,以利於樣品更好的沉降。把DNA樣品與上樣緩衝液混合,每個加樣孔加5~7μl的擴增產物。 
(6)電泳:140-160w恒功率電泳,待溴酚藍**膠的四分之三處時(大約需要1.5~2h),終止電泳,回收電泳液(可重複用一段時間,當發現電壓下降很多時要更換電泳液,或者補加蒸餾水可繼續用一段時間),取下膠板,將兩塊玻璃板輕輕分開,凝膠留在長玻璃板上。 銀染顯色 
 6.1 當**染料接近膠底邊緣,電泳結束,也可使**染料跑出;關閉ag娱乐app
移去夾子,取下玻璃板,將膠從玻璃板上小心取下,切去一角或兩個角作為記號,以便於辨認,然後開始銀染處理,處理均在搖床上進行,具體步驟如下:

注:定影液——將膠在10%的醋酸中處理結束,可向醋酸中加入少許甘油(防止膠在幹燥過程中發生膠裂),搖勻,直接用作定影液;   
銀染中應注意事項: 
① 水的質量對染色效果影響極大,一般用超純水或雙蒸水,如果水含有汙染物,膠可能不顯影或僅僅顯上部條帶;而下部空白; 
② 顯影液中碳酸鈉的純度也很重要,建議使用無水碳酸鈉; 
③ 由於溫度過高,顯影太快,所以為了便於控製顯影過程,一般將顯影液儲存
於4℃,用時取出;顯影液在4℃長期放置容易結晶,一般使用前1-2天配製即可,顯影液配製方法如下: