淺談毛細管電泳技術及在微生物學中的使用

毛細管電泳迅速發展於80年代中後期,是分析科學中繼高效液相色譜技術之後的又一重大進展,使分析科學得以從微升水平進入納升水平,並使單細胞分析乃**單分子分析成為可能[1] 。毛細管電泳(CE)是一類以毛細管為分離通道,以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。廣泛應用於核酸、蛋白質、多肽、藥物等大分子物質的分析,但是,不同於毛細管電泳在無機離子 、有機小分子和生物大分子等方麵取得的巨大成功,毛細管電泳在微生物方麵的應用在**近幾年才取得較大進展,並逐漸顯現出巨大的應用潛力。在微生物學**域,毛細管電泳除了在微生物基因測序方麵得到廣泛應用外,在微生物學檢測方麵應用的報道不多見。本文主要介紹了毛細管電泳的發展、原理、特點、分離模式及在微生物檢測中的應用。  
1、 毛細管電泳技術  
1.1毛細管電泳發展曆史 
   1937年瑞典化學家Tiselius[2]利用電泳技術**次從人血清中分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白,並研製成**台ag娱乐app,使電泳作為一種分離分析技術有了突破性的進展。經典電泳法**大的局限性在於存在焦耳熱,隻能在低電場強度下操作,直接影響了其分離效率和分析速度的提高,為了解決這一問題,人們進行了多方探索。1981年,Jorgenson和Lukacs[3]使用內徑75um的石英毛細管進行電泳,成功地對丹酰化氨基酸進行了快速,高效分離獲得了40萬塊/m理論塔板的高效率。這一開創性工作成為電泳發展史上一個裏程碑,使經典的電泳技術發展為高效毛細管電泳(HPCE)。從此,毛細管電泳在理論研究,分離模式,商品儀器,應用**域等各方麵獲得了迅猛發展。如今,HPCE可與GC、HPLC相媲美,成為現代分離科學的重要組成部分[4]。  
1.2毛細管電泳基本原理和分離模式 
按毛細管內分離介質和分離原理的不同,毛細管電泳有以下幾種分離模式[5]: 
    (1)毛細管區帶電泳 毛細管區帶電泳(CZE)的分離原理是基於各個分離物質的淨電荷與其質量比(比荷)間的差異而進行物質的分離。迄今CZE仍是應用**多的模式,應用範圍包括氨基酸、肽、蛋白、離子等的分離。(2)毛細管凝膠電泳 毛細管凝膠電泳(CGE)是將平板電泳的凝膠移到毛細管中作支持物進行電泳,不同體積的溶質分子在其分子篩作用的凝膠中得以分離。常用於蛋白質、寡聚核苷酸、核糖核酸、DNA片段分離和測序及聚合酶鏈反應(PCR)產物的分析。(3)毛細管膠束電動色譜 毛細管膠束電動色譜(MECC)是采用表麵活性劑在運動緩衝液內形成一疏水內核,外部帶負電的動態膠束相,利用溶質具有不同的疏水性,在水相和膠束相間分配的差異進行分離。主要用於小分子、中性化合物和藥物等的分離。(4)毛細管等電聚焦 毛細管等電聚焦(CIEF)是用兩性電解質在毛細管內建立pH梯度,使各種具有不同等電點的蛋白質在電場作用下遷移到等電點的位置,形成窄的聚焦區帶。已成功用於測定蛋白質的等電點、分離異構體等。(5)毛細管等速聚焦 毛細管等速聚焦(CITP)利用先導電解質和尾隨電解質,使溶質按其電泳淌度不同得以分離。現常用於富集樣品。(6)毛細管電色譜 將高效液相色譜(I-IPLC)中眾多的固定相微粒填充到毛細管中,以樣品與固定相之間的相互作用為分離機製,以電滲流為流動相驅動力的色譜過程稱毛細管電色譜(CEC)。以上6種模式為毛細管電泳基本模式,此外,如親和、**毛細管電泳發展趨勢也很好。  
1.3 毛細管電泳特點 
   毛細管電泳與高效液相色譜一樣同是液相分離技術,但無論從效率、速度、樣品用量和成本來說,毛細管電泳顯示了一定的優勢,與高效液相色譜相比,毛細管電泳柱效更高,可達105
-106  
理論塔板數/m,分離速度更快,幾十秒**幾十分鍾間完成,同時,它幾乎不消耗溶劑,而樣品用量僅為高效液相色譜幾百分之一,僅為幾十納升,毛細管電泳沒有高壓泵輸液,因此儀器成本更低,可以通過改變操作模式和緩衝液的成分,毛細管電泳有很大的選擇性,可以根據不同的分子性質對生物大分子,藥物等極廣泛的分離對象進行有效的分離,而高效液相色譜要消耗許多價格昂貴的色譜柱和流動相[6]。當然,毛細管電泳也存在一些不盡人意的地方,比如毛細管的填充需要專門的灌注技術且製備能力差,毛細管對樣本的吸附難於克服從而使其分離效率下降,電泳的高靈敏度依賴於高靈敏度的檢測儀等,這些都有賴於進一步完善。  
1.4毛細管電泳---質譜聯用 
毛細管電泳---質譜聯用綜合了二者的優點,成為分析生物大分子的有力工具,是近年來發展迅速的聯用技術。毛細管電泳---質譜聯用的應用與LC-MS的應用在方法和分析對象上有許多相似之處,如都適用於小分子和大分子的分析,熱不穩定,強極性分子及**離子型化合物的分離和分析,當然,毛細管電泳---質譜聯用尚存在缺點如濃度靈敏度低,不如LC-MS;不是所有的毛細管電泳分離模式都可方便地用於與質譜相聯用;質譜對毛細管電泳分離緩衝液的限製較多。同時,在將毛細管電泳體係與質譜儀聯用時,還有以下問題需要注意[4]:(1)無論采用套液技術還是采用十字形接口,毛細管的出口處都會帶有高電壓。因此良好的電接觸對控製接口的工作電流乃**穩定的離子化過程都是很重要的。(2)毛細管插入位置要經細心的優化,位置不當會導致電噴霧工作不穩定。(3)以往發表的毛細管電泳分離工作多數都是在磷酸鹽緩衝液中完成的,在毛細管電泳和質譜相連接時要調整為易揮發鹽的緩衝液。幾種適宜的緩衝液及其濃度:<100mmol/l的甲酸乙酸混合溶液;<50mmol/l的乙酸氨溶液;<10mmol/l十六烷基三甲基氯化銨溶液。(4)為解決毛細管電泳進樣量小,不足以在質譜上檢出的問題,可以采用等速電泳對樣品進行柱上濃縮,以提高進樣濃度。