聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質

一、 
目的 
1、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳技術; 2、掌握同工酶遺傳標記的分析方法。 二、 
原理 
聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide  gel  electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝膠為作為支持介質的一種常見電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成,聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種:化學聚合法和光聚合法。化學聚合法以過硫酸銨(AP)為催化劑,以四甲基乙二胺(TEMED)為加速器。在聚合過程中,TEMED催化過硫酸銨產生自由基,後者引發丙烯酰胺單體聚合,同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯,從而形成三維網狀結構。  由於同工酶的酶蛋白分子的大小和結構不同,攜帶的電荷種類和數量不同,所以可用凝膠電泳將它們一一分開。在適宜酶催化反映的條件下提供酶作用的底物,再利用特殊的顯色反應以顯示產物的形成或底物的消失,就可以看到經電泳分離後的同工酶譜帶。同工酶的鑒定過程通常如下: 
1、從植物樣品中提取粗酶液; 
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳把樣品中酶帶分開; 
  用專一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色,顯示同工酶譜。 
同工酶技術是通過電泳和組織化學方法進行特異性染色而把酶蛋白分子分離,並將其位置和活性直接在染色區帶以酶譜的形式標記出來。分離同工酶的方法有:電泳法、層析法、酶學法和**學其中以電泳法**為普遍,電泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率為**好。聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種物理效應:1、樣品的濃縮效應;2、凝膠的分子篩效應;3、一般的電泳分離的電荷效應。 三、 
儀器、設備、藥品及材料 
儀器、設備:ag娱乐app電泳槽、離心機、移液管、裝凝膠用的玻璃管(內徑為5mm、長度為90mm)。
藥品:三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺(Acr)、價差雙丙烯酰胺(Bir)、甘氨酸、過硫酸銨(AP)、蔗糖、溴酚藍、聯苯胺、過氧化氫。 
材料:雞爪菜(棒菜)和紅莧葉片和其他植物的葉片。 四、 
內容 
1、樣品的提取 
不同品種或種間的植物,取發育時期相同,組織相同的樣品,製備酶粗提液。一般取樣0.5g,或在恒溫條件下發芽的幼苗3~5個,置於研缽中,加入0.1~0.5ml水研磨勻漿、後將樣品移**小離心管中離心(3000rpm)15min,取上清液,混入等體積的50%的蔗糖溶液,電泳前可在冰箱中保存。 2、聚丙烯酰胺凝膠係統的配製 
A液:1mol/l Hcl 48.0 ml,Tris 36.4 克 ,TEMED 0.23 ml加水**100 ml pH 8.3。 B液:丙烯酰胺 28.0克 ;甲叉雙丙烯酰胺 0.735 克 加水**100 ml。 C液:過硫酸銨(用前配製)1.4 % 。 配膠:A:B:C:H2O = 1:2:0.4:4.6 配膠後立即灌好裝膠的玻璃管 3、點擊緩衝液配製 
Tris 30.0克;甘氨酸14.4克加水**1000毫升、pH 8.3、使用時稀釋10倍。 4、染色液配製——過氧化物酶染液 
醋酸聯苯胺溶液5毫升,3% H2O2 毫升,H2O 93 毫升。 5、加樣和電泳 
各根凝膠管加入0.05毫升的樣品酶粗提液0.05毫升。加一小微滴0.005%溴酚藍,上下電泳槽加電極緩衝液後在低於15攝氏度氣溫中,每管電流2mA進行電泳,當溴酚藍遷**凝膠下端0.5-1厘米是停止電泳。電泳時間3-4小時。 6、用長針頭注射器注水法自凝膠管中取出凝膠,凝膠要完整,不能斷裂。 7、染色:將完整的凝膠條置於中號試管中,加入染色液,浸入整條凝膠,室溫下染色20-30分鍾,呈現酶帶後取出凝膠,用水漂洗終止染色。 8、帶型清楚的膠應作攝影記錄或做掃描測定,膠晾幹後還作**保存。 
五、 
數據記錄 
1、將各膠柱中酶帶條數、寬度、著色深淺和移動距離填入表中。 
3、選擇比較組分膠柱中、著色**深的酶帶或特殊酶帶(即該組分特有的酶帶),計算酶帶的相對遷移率Rf值 Rf=(某酶帶遷移距離)/(溴酚藍指示劑遷移距離)  六、 
結果討論及分析 
1、配製緩衝液係統對電泳的影響: 
在SDS-PAGE不連續電泳中,製膠緩衝液使用的是Tris-HCL緩衝係統,濃縮膠是PH6.7,分離膠PH8.9;而電泳緩衝液使用的Tris-甘氨酸緩衝係統。在濃縮膠中,其PH環境呈弱酸性,因此甘氨酸解離很少,其在電場的作用下,泳動效率低;而CL離子卻很高,兩者之間形成導電性較低的區帶,蛋白分子就介於二者之間泳動。由於導電性與電場強度成反比,這一區帶便形成了較高的電壓梯度,壓著蛋白質分子聚集到一起,濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠後,由於膠中PH的增加,呈堿性,甘氨酸大量解離,泳動速率增加,直接緊隨氯離子之後,同時由於分離膠孔徑的縮小,在電場作用下,蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。 
所以,pH對整個反應體係的影響是**關重要的,實驗中在排除其他因素之後仍不能很好解決問題的情況,應**要考慮該因素。 2、樣品的處理: