瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響

1、DNA的分子大小及構型  
不同構型DNA的移動速度次序為:供價閉環DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難於在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。當瓊脂糖濃度太高時,環狀DNA(一般為球形)不能進入膠中,相對遷移率為0(Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(Rm>0),由此可見,這三種構型的相對遷移率主要取決於凝膠濃度。  
2、瓊脂糖濃度  
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關係。凝膠濃度的選擇取決於 DNA分子的大小。分離小於0.5kb的DNA段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大於10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA段大小間於兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。  
3、DNA分子的構象  
當DNA分子處於不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動**快,而線狀雙鏈DNA移動**慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限製性內切酶分別水解,然後電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。  
4、電源電壓  
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場強度增加時,不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離範圍將縮小。要使大於2kb的DNA段的分辨率達到**大電場強度不宜高於5V/cm。  
5、嵌入染料的存在  
熒光染料溴化乙啶用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。 
 
6、離子強度影響  
電泳緩衝液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠),電導率**小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩衝液中(如誤加10×電泳緩衝液),則電導很高並明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。對於天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩衝液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配製成濃縮母液,儲於室溫。