非變性凝膠電泳簡述

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)原理、方法步驟與常見問題分析[轉]2009-12-09 20:27Native-PAGE原理  
非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的條件下, 對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,常用於同工酶的鑒定和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用,因而可以得到較高的分辨率,尤其是在電泳分離後仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性,對於生物大分子的鑒定有重要意義,其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳,電泳後將凝膠切成兩半,一半用於活性染色,對某個特定的生物大分子進行鑒定,另一半用於所有樣品的染色,以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。  
實驗方法  
非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的,隻是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配製和電泳緩衝液中不能含有變性劑如SDS等。  
一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時候,要利用低pH凝膠係統,分離酸性蛋白時候,要利用高pH凝膠係統。  
酸性蛋白通常在非 變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩衝係統,蛋白會帶負電荷,蛋白會相陽極移動;而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離酸性蛋白。  
工作液配製  
1.40%膠貯液(Acr:Bis=29:1);  
2.4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8):18.2 g Trisbase 溶於ml 水,用濃HCl調pH 8.8,加水定容到100ml,4℃貯存;  
3. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8):6g Trisbase 溶於80ml 水,用濃HCl調pH 6.8,加水定容到100ml,4℃貯存;  
4.10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):30.3 g Trisbase, 144g 甘氨酸,加水定容到L,4℃貯存;  
5.2×溴酚藍上樣Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl,3.0ml甘油,.2ml 0.5% 溴酚藍,5.5ml dH2O; -20℃貯存;  
6. 10%APS;  
7. 0.25%考馬斯亮藍染色液:Coomassie blue R-250 2.5g,甲醇450ml,HAc 100ml, dH2O 450ml; 8.考馬斯亮藍脫色液:100ml甲醇,100冰醋酸,800ml dH2O  
電泳膠的配製及電泳條件(上槽電極為負,下槽電極為正)  
1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)  
2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C) 4.25ml 0.5ml  
3. 4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8)2.5ml   
4. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8) 1.25ml  
5. 水 3.2ml   
6. 10%APS 35ul 7. TEMED 15 ul 
8. 10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):100ml稀釋到L  
電泳條件:100V恒壓約20min,指示劑進入濃縮膠;改換160V恒壓,當指示劑移動到膠板底部時,停止電泳,整個過程約80min。  
染色和脫色:取出膠板於0.25%考馬斯亮藍染色液中染色約30min,傾出染色液,加入考馬斯亮藍脫色液,緩慢搖動,注意更換脫色液,直**膠板幹淨清晰背景。也可以用銀染或者活性染色。  
分離堿性蛋白  
要用低pH凝膠係統,並使用以下緩衝液體係:  
1. 分離膠:0.06M KOH,0.376M Ac,pH4.3(7.7% T,2.67% C);  
2. 堆積膠:0.06M KOH,0.063M Ac,pH6.8(3.125% T,25% C);  
3. 電泳緩衝液:0.14M 2-丙氨酸,0.35M Ac,pH4.5  
將正負電極倒置,用甲基綠(0.002%)為示蹤劑  
實驗操作同分離酸性蛋白。   
SDS-PAGE和Native-PAGE的比較  
非變性凝膠電泳,也稱為天然凝膠電泳,與非變性凝膠電泳**大的區別就在於蛋白在電泳過程中和電泳後都不會變性。**主要的有以下幾點:
 
1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS,而變性凝膠的有SDS。  
2. 電泳載樣緩衝液中非變性凝膠的不僅沒有SDS,也沒有巰基乙醇。  
3. 在非變性凝膠中蛋白質的分離取決於它所帶的電荷以及分子大小,不像SDS-PAGE電泳中蛋白質分離隻與其分子量有關。  
4. 非變性凝膠電泳中,酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的,不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微  
酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。  
5. 因為是非變性凝膠電泳,所有的電泳時候電流不能太大,以免電泳時產生的熱量太多導致蛋白變性,而且步驟都要在0-4度的條件下進行,這樣才可以保持蛋白質的活性,也可以降低蛋白質的水解作用。這點跟變性電泳也不一樣。  
所以與SDS-PAGE電泳相比,非變性凝膠大大降低了蛋白質變性發生的機率  
問題和解答  
1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預電泳是怎麽回事的?預電泳時要加6×DNA上樣緩衝液嗎?電泳1-2小時再加結合反應產物嗎?  
預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發劑,提高分辨率,不加任何物質,一般30-60分鍾後加樣電泳。2. 銀染的步驟是什麽?銀染的**因素是什麽?  
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