瓊脂糖凝膠電泳注意事項和常見問題簡述

瓊脂糖凝膠電泳注意事項和常見問題 
核酸分子是兩性解離分子,在高於其等電點的電泳緩衝液中,其堿基不解離,而磷酸基團全部解離,核酸分子因而帶負電荷,電泳時向正極遷移。瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來並經糖基化修飾,為一種聚合鏈線性分子,使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質,發揮分子篩功能,使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現較大差異,從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠電泳操作簡單、快速,通過調整其使用濃度,使得分辨率達到大多數實驗的要求,因此成為分離、鑒定、純化核酸分子的常用方法。但操作過程中仍有不少要注意的問題。 1 凝膠製作 
1.1 凝膠濃度 配製凝膠的濃度據實驗需要而變 ,一般在0.8% ~2.0%之間,如果一次配製凝膠100 ml,沒用完的凝膠可以再次融化,但隨著融化次數的增加,水分丟失也越多,凝膠濃度則會越來越高,導致實驗結果不穩定,補水辦法:一是在容器上標記煮膠前的刻度,煮膠後補充相應的水分**原刻度;二是在煮膠前稱重,煮膠後補充水**原重量。粗略一點的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個經驗補水值。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中,終濃度為0.5 t*g/ml;也可在電泳結束後染色。 
1、2 梳板的選用 一般每個製膠模具均配有多個齒型不同的梳板,梳齒寬厚,形成的點樣孑L容積較大,用於DNA 片段回收實驗等;相反,梳齒窄而薄,形成的點樣孑L容積就較小,用於PCR產物、酶切產物鑒定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定,一般來說,上樣量小時盡量選擇薄的梳板製膠,此時電泳條帶致密清晰,便於結果分析。另外,每次製膠時都要注意梳齒與底板的距離**少要1 mm,否則,拔梳板時易損壞凝膠孑L底層,導致點樣後樣品滲漏。當然,點樣孑L的破壞還與拔梳板的時間和方法有關,一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板,應急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右,拔梳板的方法是將製膠槽放置在電泳槽中的電泳緩衝液中,然後垂直向上慢慢用力,因為有液體的潤滑作用,梳板易拔出且不易損壞點樣孑L。 2 點樣 
點樣需加上樣緩衝液,因為上樣緩衝液中加了甘油或蔗糖增加密度,使樣品沉入孑L底;指示樣品的遷移過程,上樣緩衝液中一般加了兩種指示劑,溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑並非染色劑,DNA染色劑是溴化乙錠,而且要在紫外光的激發下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩衝液儲存液一般為6× (10×),表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時上樣緩衝液應稀釋到一倍濃度。點樣方法是將移液器基本垂直點樣孑L,用另一隻手幫助固定移液器下端,移液器槍頭(Tip)**進入點樣孑L即可將樣品注入孑L內,千萬不可將Tip尖插**孑L底,並點上適合的DNA分子量標準,所謂適合是指樣品DNA分子量大小應基本在DNA分子量標準範圍之內。 3 電泳 
ag娱乐app的正極與電泳槽的正極相連,負極與負極相連,核酸帶負電荷,從負極向正極移動。電泳槽中電泳緩衝液與製膠用電泳緩衝液應相同,電泳緩衝液剛好沒過凝膠1 mm 為好,電泳緩衝液太多則電流加大,凝膠發熱。電泳時凝膠上所加電壓一般不超過5 v/cm(指的是正負電極之間的距離,而不是凝膠的長度),電泳時間一般為3O~60 min,根據實驗需要也可作適當調整,電壓增高,電泳時間縮短,核酸條帶相對來說不夠整齊,不夠清晰;相反,電壓降低,電泳時間較長,核酸條帶整齊清晰。另外,如果電泳後樣品泳動很慢或者沒泳動,請檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。 4 結果分析         
較成功的電泳結果是分子量標準條帶整齊清晰,樣品條帶也整齊清晰,如果條帶模糊暗淡,單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說,可能的原因:溴化乙錠的質和量怎樣?溴化乙錠見光易分解,母液配製時間過長或保存不當(一般4℃ 避光保存一年內有效),或者終濃度沒達到0.5 vg/ml;電泳槽中緩衝液使用次數過多,緩衝能力下降。特別是TAE緩衝液,一般用2~3次就要更換,TBE緩衝液則可使用10次左右。 
實際工作中經常發現DNA 分子量標準小片段模糊不清,那足因為瓊脂糖凝膠濃度一般不會超過2 0% ,較小的核酸片段 在它的分辨範圍之內,並且EB帶正電荷,電泳時會向負傲移動,如果將凝膠置含EB(0.5#g/m1)的水溶液中30 min,較小的片段則可重新染色:另外,溴化乙錠(EB)是一種中等強度誘變劑,操作過程中要戴手套,並將加有EB的染色液作好標記、妥善保存