SDS-PAGE電泳測定蛋白質相對分子質量概述

實驗原理 
    SDS-PAGE電泳法,即十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳法,。 
1.在蛋白質混合樣品中各蛋白質組分的遷移率主要取決於分子大小和形狀以及所帶電荷多少。 
2.在聚丙烯酰胺凝膠係統中,加入一定量的十二烷基硫酸鈉(SDS),SDS是一種陰離子表麵活性劑,加入到電泳係統中能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開,並結合到蛋白質分子上(在一定條件下,大多數蛋白質與SDS的結合比為1.4gSDS/1g蛋白質),使各種蛋白質—SDS複合物都帶上相同密度的負電荷,其數量遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷量,從而掩蓋了不同種類蛋白質間原有的電荷差別。此時,蛋白質分子的電泳遷移率主要取決於它的分子量大小,而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。  
3. 當蛋白質的分子量在15000~200000之間時,電泳遷移率與分子量的對數值呈直線關係,符合下列方程:  
                     1gMr =K―bmR 
            式中:Mr為蛋白質的分子量;K為常數;b為斜率;mR為相對遷移率。在條件一定時,b和K均為常數。 
            若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量的對數作圖,可獲得一條標準曲線。未知蛋白質在相同條件下進行電泳,根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。

儀器、原料和試劑 
儀器:垂直板型電泳槽;直流穩壓電源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴鍋,染色槽;燒杯;吸量管;常頭滴管等。 
原料:低分子量標準蛋白質按照每種蛋白0.5~1mg·ml-1樣品溶解液配製。可配製成單一蛋白質標準液,也可配成混合蛋白質標準液。 試劑: 
   (1)分離膠緩衝液(Tris-HCl緩衝液 PH8.9):取1mol/L鹽酸48mL,Tris 36.3g,用無離子水溶解後定容**100mL。 
   (2)濃縮膠緩衝液(Tris-HCl緩衝液 PH6.7):取1mol/L鹽酸48mL, Tris 5.98g,用無離子水溶解後定容**100mL。 
   (3)30%分離膠貯液:配製方法與連續體係相同,稱丙烯酰胺(Acr) 30g及N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g,溶於重蒸水中,**後定容**100ml,過濾後置棕色試劑瓶中,4℃保存。    (4)10%濃縮膠貯液:稱Acr 10g及Bis 0.5g,溶於重蒸水中,**後定容**100mL,過濾後置棕色試劑瓶中,4℃貯存。 
   (5)10%SDS溶液:SDS在低溫易析出結晶,用前微熱,使其完全溶解。    (6)1%TEMED; 
    (7)10%過硫酸銨(AP):現用現配。 
   (8)電泳緩衝液(Tris-甘氨酸緩衝液PH8.3):稱取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用無離子水溶解後定容**1L。 
   (9)樣品溶解液:取SDS 100mg,巰基乙醇0.1mL,甘油1mL,溴酚藍2mg,0.2mol/L,pH7.2磷酸緩衝液0.5mL,加重蒸水**10mL(遇液體樣品濃度增加一倍配製)。用來溶解標準蛋白質及待測固體。 
   (10)染色液:0.25g考馬斯亮藍G-250,加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。    (11)脫色液:75mL冰乙酸,875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。 實驗步驟 
1. 安裝夾心式垂直板電泳槽:目前,夾心式垂直板電泳槽有很多型號,雖然設置略有不同,但主要結構相同,且操作簡單,不易泄漏。同學們可根據具體不同型號要求進行操作。主要注意:安裝前,膠條、玻板、槽子都要潔淨幹燥;勿用手接觸灌膠麵的玻璃。 
2.配膠:根據所測蛋白質分子量範圍,選擇適宜的分離膠濃度。本實驗采用SDS-PAGE不連續係統,按下表的配製分離膠和濃縮膠。 
重蒸餾水  
11.87 10.20 8.54 5.20 4.60 
混勻後,置真空幹燥器中,抽氣10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 
 
3.製備凝膠板: 
   (1)分離膠製備:按表配製20ml 10%分離膠,混勻後用細長頭滴管將凝膠液加**長、短玻璃板間的縫隙內,約8cm高,用1ml注射器取少許蒸餾水,沿長玻璃板板壁緩慢注入,約3—4mm高,以進行水封。約30min後,凝膠與水封層間出現折射率不同的界線,則表示凝膠完全聚合。傾去水封層的蒸餾水,再用濾紙條吸去多餘水分。 
   (2)濃縮膠的製備:按表配製10ml 3%濃縮膠,混勻後用細長頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方,直**距離短玻璃板上緣約0.5cm處,輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內,避免帶入氣泡。約30min後凝膠聚合,再放置20—30min。待凝膠凝固,小心拔去樣品槽模板,用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多餘的水分,將pH8.3 Tris-甘氨酸緩衝液倒入上、下貯槽中,應沒過短板約0.5cm以上,即可準備加樣。   
4.樣品處理及加樣 
    各標準蛋白及待測蛋白都用樣品溶解液溶解,使濃度為0.5~1mg/mL,沸水浴加熱3分鍾,冷卻**室溫備用。處理好的樣品液如經長期存放,使用前應在沸水浴中加熱1分鍾,以消除亞穩態聚合。