DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗原理和操作步驟簡述

一、試驗意圖 
瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢查核酸的辦法,學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的運用技能,掌握有關的技能和識讀電泳圖譜的辦法。 二、試驗原理 
瓊脂糖凝膠電泳是常用的用於別離、鑒定DNA、RNA分子混合物的辦法,這種電泳辦法以瓊脂凝膠作為支持物,運用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應,到達別離混合物的意圖。DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電,在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下,DNA分子的搬遷速度取決於分子篩效應,即分子自身的巨細和構型是**要的影響要素。DNA分子的搬遷速度與其相對分子量成反比。不一樣構型的DNA分子的搬遷速度不一樣。如環形DNA分子樣品,其中有三種構型的分子:共價閉合環狀的超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不一樣構型分子進行電泳時的搬遷速度巨細次序為:cccDNA>IDNA>ocDNA 
核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是堿基上的氨基解離,而三個磷酸基團中隻要一個磷酸解離,所以分子帶正電,在電場中向負極泳動;而 pH8.0-8.3時,堿基幾乎不解離,而磷酸基團解離,所以核酸分子帶負電,在電場中向正極泳動。不一樣的核酸分子的電荷密度大致一樣,因而對泳動速度影響不大。在中性或堿性時,單鏈DNA與等長的雙鏈DNA的泳動率大致一樣。 
影響核酸分子泳動率的要素**要是: 1、樣品的物理性狀 
即分子的巨細、電荷數、顆粒形狀和空間構型。通常而言,電荷密度愈大,泳動率越大。可是不一樣核酸分子的電荷密度大致一樣,所以對泳動率的影響不明顯。 
對線形分子來說,分子量的常用對數與泳動率成反比,用此規範樣品電泳並測定其泳動率,然後進行DNA分子長度(bp)的負對數——泳動間隔作規範曲線圖,能夠用於測定不知道分子的長度巨細。 
DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大,比方質粒分子,泳動率的巨細次序為:cDNA>IDNA>ocDNA可是因為瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響,會呈現相反的狀況。 2、支持物介質 
核酸電泳通常運用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質,瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。含有不一樣濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔巨細不一樣,是於別離不一樣濃度規模的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)的催化下聚合形生長鏈,並經過交聯劑N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)穿插銜接而成,其網孔的巨細由Acr與Bis的相對份額決議。 
瓊脂糖凝膠合適別離長度100**60的分子,而聚丙烯酰胺凝膠關於小片段(5bp-500bp)的別離作用**佳。挑選不一樣濃度的凝膠,能夠別離不一樣巨細規模的DNA分子。 3、電場強度 
電場強度愈大,帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有用別離規模跟著電壓增大而減小,所以電泳時通常選用低電壓,不超越4V/cm。而關於大片段電泳,乃**用0.5-1.0V/cm電泳過夜。進行高壓電泳時,隻能運用聚丙烯酰胺凝膠。 4、緩衝液離子強度 
核酸電泳常選用TAE、 TBE、TPE三種緩衝體係,但它們各有利弊。TAE價格低廉,但緩衝才能低,**進行南北極緩衝液的循環。TPE在進行DNA收回時,會使DNA汙染磷酸鹽,影響後續反響。所以多選用TBE緩衝液。 
在緩衝液中參加EDTA,能夠鼇合二價離子,按捺DNase,維護DNA。 緩衝液pH常偏堿性或中性,此刻核酸分子帶負電,向正極移動。 
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(ethidium bromide EB)。溴化乙錠是一種扁平分子,能夠嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照耀BE-DNA複合物時,呈現不一樣的效應。254nm的紫外線照耀時,靈敏度**高,但對DNA損害嚴峻;360nm紫外線照耀時,盡管靈敏度較低,但對DNA損害小,所以合適對DNA樣品的調查和收回等操作。300nm紫外線照耀的靈敏度較高,且對DNA損害不是很大,所以也對比適用。