BIORADag娱乐app及SDS-PAGE凝膠電泳操作規範簡述

實驗原理 
根據蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白,在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去汙劑和強還原劑後,蛋白質亞基的電泳遷移速率主要取決於亞基分子量的大小。 實驗所用儀器 
FR-200A全自動紫外與可見分析裝置   上海複日科技有限公司 ag娱乐app   BIO-RAD公司 
TS-1型脫色搖床  江蘇海門市其林貝爾儀器製造有限公司 實驗用試劑 
低分子量蛋白Maker     TAKARA 4*上樣緩衝   TAKARA 
Pagn Blue protein staining solution   Fermentas 試劑的配製 1. 貯液的配製 (1) 凝膠儲液 
取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉雙丙烯酰胺0.8g ,先用35ml雙蒸水溶解,攪拌,直到溶液變成透明,再用雙蒸水稀釋**100ml,過濾。棕色瓶4℃保存一個月。 (2)1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8) 
12.1g Tris(三羥甲基氨基甲烷)溶解在80ml雙蒸水中,用4mol/l鹽酸調PH**8.8。再用雙蒸水稀釋**100ml,保存在4℃冰箱。 (3)1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8) 
6.06g Tris溶解在40ml雙蒸水中,用用4mol/l鹽酸調PH**6.8。再用雙蒸水稀釋**50ml,保存在4℃冰箱。 (4)10%過硫酸銨(APS) 
0.1g過硫酸銨+1ml雙蒸水。使用前新鮮配製(5)Tris–甘氨酸電泳緩衝液的配製(25mmol/L Tris;250mmol/L甘氨酸(pH8.3)) 
30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS,雙蒸水定容**1L。 每次使用時10倍稀釋。 (6) 樣品緩衝液 
使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司),上樣緩衝與樣品比例1:3混勻,之後煮沸5min。  2. 凝膠的配製 

具體步驟如下: 
1、樣品製備:40 µL蛋白+5*上樣緩衝液10 µL,煮沸5 min,冷卻後放冰箱下層保存,備用 
2、製膠 
1) 用專用的醫用棉口罩將膠板擦拭幹淨,電泳槽清洗幹淨,組裝模具。 
注:**使用專用的棉口罩擦拭膠板,且輕輕的向一個方向擦拭,以免劃壞膠板。 
膠板和電泳槽未清洗幹淨,會影響電泳效果。 
2) 按上表成分配製分離膠,迅速搖勻,沿膠的一邊,迅速灌入分離膠,注意勿打入氣泡,
迅速水封。 3) 放置1.5h。 
4) 傾去蒸餾水,用濾紙將未倒幹淨的水吸幹。 
5) 按上表成分配製濃縮膠,迅速搖勻,沿膠的一邊,迅速灌入濃縮膠,注意勿打入氣泡,
迅速插入齒梳。 6) 放置1h。 注:新配置的凝膠,室溫放置5h,使膠充分凝聚、混勻,之後再使用,效果更好。忌馬上電泳。 
3、配製電泳緩衝及上樣 
取配好的10*電泳緩衝130ml,用蒸餾水稀釋**1300ml。 
將製好的凝膠用電泳夾固定**電泳槽中。注:短板朝裏。若隻跑一塊膠,電泳夾的對麵也**放置一塊電泳板。 
倒入電泳緩衝液,液麵**短板和長板之間。 每孔上樣量**大20ul。蛋白Maker上樣量7ul。 
4、 電泳 
80V 45min;120V 45min。 
注:若120v 45min後,溴酚藍指示劑前沿距離電泳板下端太遠,可延長電泳時間,或適當增加電壓,待跑**距電泳板下端1cm時停止電泳。 5、 剝膠 
剝膠過程**浸在蒸餾水中進行。 6、 水洗 
電泳結束後,用蒸餾水洗膠三次,每次10min。 7、 染色 
將膠**於脫色搖床上,使用考馬斯亮藍染色液(fermentas公司)過夜染色。 注:考馬斯亮藍染色液的使用,請嚴格按照染色液說明上的操作步驟進行。 
考馬斯亮藍染液可重複利用3次,使用一次的染液請倒回使用一次的回收瓶中,使用過兩次的染色液倒回使用兩次的回收瓶中,用滿三次才可廢棄。 8、 水洗 
蒸餾水洗1-2小時,洗去背景色。拍照。 9、 清洗膠板和電泳槽。 
注:清洗和擦拭膠板時,請使用專用的醫用棉口罩清洗,用水衝洗時,輕輕擦拭,將殘留的膠清洗幹淨,注意不要太用力,以免劃壞膠板。洗好後,放置專用的膠架上晾幹,晾幹後放入相應的膠盒中。 10、 
清理實驗台,將實驗儀器擺放整齊。