SDS-PAGE電泳具體步驟概述

一、清洗玻璃板 1、洗潔精輕輕擦洗 2、自來水衝 3、蒸餾水衝 4、筐裏晾幹 5、梳子用水洗 二、配膠 

材料:玻璃板、梳子、架子、槍(100-1000、20-200、2-20)、DDW、30%Arc-Bis、Tris(pH8.8)、Tris(pH6.8)、10%SDS、10%AP、TEMED。 1、玻璃板對齊後放入夾中卡緊 2、配分離膠 

3、加入玻璃板中 4、加入乙醇1ml 等待0.5小時 

5、用注射器吸出乙醇, 

6、用水衝洗分離膠3次,第4次**後(加入AP、TEMED前)再用注射器吸出 7、配濃縮膠 8、將玻璃板加滿 9、放入小梳子 等待0.5小時 

三、上樣 

材料:蛋白、marker、針筒、電泳槽、電泳液、槍(2-20ul) 

1、把玻璃板取下,放入小架子,固定於電泳槽(大玻璃板朝外),拔梳子,(若隻有一塊膠,對麵用塑料板) 

2、將小架子加滿電泳液,標記位置,用針筒抽電泳液通膜 3、根據要求上樣蛋白(如海馬),**外側加馬克,用2-20ul槍 四、電泳 

1、放入電泳盒中,盒中加少量電泳液,放上蓋子 2、開電泳機 

電壓先60V,馬克到達分離膠後調製110V,等待約2小時 五、轉膜 

材料:6張濾紙、1張PVDF膜(根據分離膠剪,無水甲醇中浸泡1min~2min)、轉膜夾、轉膜緩衝液 

1、取膠,將濃縮膠輕輕刮去,去掉多餘的分離膠, 

2、將裁好的膠、浸過甲醇的PVDF膜和濾紙放入轉膜緩衝液中,10min左右, 3、黑色板在下麵,紙—膠—膜—紙(注意趕走氣泡) 

4、轉膜夾放入電泳槽,放滿轉膜緩衝液,外麵放冰塊,加滿水 等待120分鍾,電壓100V 

六、**反應 

材料:麗春紅、TBST、5%牛奶、一抗、二抗 1、取出一小盒,加入少量麗春紅,(用完回收)2、把膜取出,扔掉膠,依次放麗春紅——TBST,(搖床上) 

3、膜剪成小條帶,放入方格盒,放入TBST(搖床),幾分鍾後放入5%牛奶中封閉抗原(搖床) 等待1小時 

4、配一抗:配5%的牛奶(5g牛奶,加TBST**100ml),將抗體放入牛奶中。 5、包一抗:將膜放入盛有抗體的5%的牛奶中,搖床上1小時 6、4℃冰箱中過夜 

7、第2天,取出膜,TBST中洗,10分鍾X3次 8、加入二抗,封膜,搖床上,1.5—2h 七、化學發光 

準備材料:黃色槍頭、20-200ul槍、剪刀、鑷子、保鮮膜、板、solution、reagent、小盒中的膜 

1、 取出膜,TBST中洗,10分鍾X3次 2、膜放入盒中 

3、加solution、reagent**膜上,(A:B=1:1,約60ul) 4、膜放入保鮮膜上包好 

5、膜放入板上進屋 

6、剪膠片放在膜上下,夾在板裏, 等待1小時 

7、膠片先放入顯影液中 8、膠片先放入定影液中 9、用水衝洗幹淨