五種電泳技術的比較參數

五種電泳技術的比較 SDSPAGE 
  名詞解釋: 
  相對遷移率(Rf)    
  問答題: 
  1.簡述SDS-PAGE的基本原理。   2.影響SDS電泳的**因素有哪些?  AGE 
 名詞解釋 1.遷移率 2.電滲 3.電泳 
 問答題 
1.影響電泳遷移率的因素有哪些? 
2.試述瓊脂糖凝膠電泳分離脂蛋白的原理。 CAME 
1.CAME的基本原理是什麽? 
2.CAME分離血清蛋白電泳時應注意哪些問題? PAGE 名詞解釋 
1.凝膠總濃度 2.交聯度 問答題 
1.與CAME相比,PAGE有哪些特點。 2.試比較CAME與PAGE操作的區別。 3.簡述不連續PAGE的原理。 
 
1.瓊脂糖凝膠電泳Agarose Gel Electrophoresis 
 Gel Electrophoresis :由瓊脂、瓊脂糖、澱粉膠及聚丙烯酰胺等物質作支持體的電泳。  特點(characteristic): 
1.可以製成非常均勻的凝膠,帶電質點在凝膠的孔中泳動。  2. 電泳操作方法簡便,電泳速度快。 
3. 分辨率高,重複性好,電泳圖譜清晰。 4. 適用於生化,**等定性定量測定。 (一)優點(advantage) 
1.因不含硫酸根和羧基,幾乎消除了瓊脂的電滲。 
2.對蛋白質吸附極微,故無拖尾現象。 
3.凝膠結構均勻,孔徑較大,可用來分離酶的複合物、核酸、病毒 等大分子物質。 4.透明度較好,可直接或幹燥成薄膜後進行染色。 
5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量測定。 6.有熱可逆性。 
(二)缺點(disadvantage) 
1.機械強度差,易破碎,濃度不能太低。2.易被細菌汙染,不易保存,臨用前配製。 
3.瓊脂糖支持層上的區帶易於擴散,電泳後**立即固定染色。 4.與PAGE相比,分子篩(molecular sieve)作用小,區帶少。  應用 
1. 適用於大分子的核酸、核蛋白等的分離、鑒定及純化 2. 臨床生化檢驗中常用於LDH、CK等同工酶的分離與檢測 3. 為不同類型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指標   影響遷移的因素 
 the size of the molecule 
 conformation of the molecule   the agarose concentration of a gel  Voltage 
百分濃度和分辨率限製 
 Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 
5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.  
 Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide 
gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.  
 Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High 
percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications.  
瓊脂糖凝膠分離血漿脂蛋白 
原理:      血清脂蛋白經飽和蘇丹黑B預染後,以瓊脂糖凝膠為支持介質,在pH8.6巴比妥緩衝液中電泳,根據各脂蛋白的組成、大小、形狀分離成不同區帶。 
 pH 8.6 > pI ,各種脂蛋白均帶負電,電泳時由負極到正極;VLDL為圓形,受阻力小,LDL形態不規則,受阻力大,所以VLDL跑在前。 加樣槽在負極,由負極到正極分別是CMLDLVLDLHDL 
2.醋酸纖維薄膜電泳Cellulose acetate membrane electrophoresis,CAME 特點:低吸附作用,低電滲作用,樣本用量少,親水性 1.Low sorption 2.Low electroosmosis  3.Small sample 4.Hydrophilic  電泳圖譜不齊 
①點樣時血清點加不均勻 ②薄膜局部幹燥 
③電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少 ④緩衝液變質 
⑤電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行  電泳圖譜分理不清 
①點樣時血清點加不均勻 
②薄膜局部幹燥 
③電泳時供給薄膜的液量不均勻或過少 ④緩衝液變質 ⑤電泳時薄膜位置不正,與電流方向不平行  電泳速度慢 
 電流過低 
 供給薄膜的液量不足  緩衝液離子強度過高 
 薄膜中雜質  
白蛋白區帶中間部分不著色,染色不足 染色時間不夠、點樣過多 γ球蛋白向反方向移動 
電滲現象,可提高緩衝液液麵或加大電流量以改進 區帶一邊長一邊短呈扭曲現象 
薄膜未緊壓在電泳槽的濾紙橋上,使薄膜接觸不良而增大了電阻。  
區帶拖尾或區帶過於緊密 
緩衝液離子強度<0.05可出現區帶拖尾;離子強度>0.075可出現區帶過於緊密。 血清蛋白質醋酸纖維薄膜電泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis 
[原理] CAME是以醋纖膜(CAM)作支持物的一種區帶電泳技術。 
      將血清樣品點樣於醋纖膜上,在pH8.6的緩衝液中電泳時,血清蛋白質均帶負電荷移向正極。由於血清中各蛋白組分等電點不同而致表麵淨電荷量不等,加之分子大小和形狀各異,因而電泳遷移率不同,彼此得以分離。加樣:用加樣器蘸取血清約5ul,垂直印在CAM粗糙麵,點樣區距離邊緣約1.5cm,電泳時點樣麵朝下。加上槽蓋平衡5分鍾後再通電。電壓10~15V/cm膜總寬。電泳40~60分鍾,泳動距離約達3.5~4cm時即可斷電。 由負極到正極可分為五條條帶 γ β α2 α1 白蛋白