瓊脂糖凝膠電泳標準操作流程介紹

一、實驗目的 
瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法,具有操作方便、經濟快速等優點。本銅人陣學習DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術, 此關為能力考核,通關成功後,代表具備操作瓊脂糖電泳的能力。  
二、實驗原理  
     瓊脂糖凝膠電泳是常用的用於分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法,這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電,在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下,DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環形DNA分子樣品,其中有三種構型的分子:共價閉合環狀的超螺旋分子(cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNA>IDNA>ocDNA 
影響核酸分子泳動率的因素主要還是:1、DNA分子大小;2、瓊脂糖濃度;3、DNA構想;4、所用的電壓;5、瓊脂糖種類;6、電泳緩衝液 
核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(ethidium bromide EB)。溴化乙錠是一種扁平分子,可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射BE-DNA複合物時,出現不同的效應。254nm的紫外線照射時,靈敏度**高,但對DNA損傷嚴重;360nm紫外線照射時,雖然靈敏度較低,但對DNA損傷小,所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm紫外線照射的靈敏度較高,且對DNA損傷不是很大,所以也比較適用。  
三、材料、試劑及器具 1、材料 
不同大小的基因組片段;2、試劑 
Hind III digest DNA Marker(分子量標準)(TaKaRa);D2000(TianGen); BIOWESTAGAROSE(西班牙瓊脂糖);加樣緩衝液(6x):溴酚黃;電泳緩衝液(1×TAE);溴化乙錠(EB);  3、儀器及器具 
(1)移液器、吸頭、錐形瓶 
(2)電泳係統ag娱乐app、水平電泳槽、托盤、膠托、梳子等。 (3)紫外透射儀、微波爐、電子天平  
四、操作步驟 
1.器具清洗:**先將配膠、電泳、染膠所需要的器具清洗幹淨,包括托盤、膠托、梳子、電泳槽、染膠盤(EB汙染,需獨立清洗)。清洗流程為:先用自來水衝洗三次,然後用純水衝洗三次,**後用紙巾或醫用紗布擦幹。若需對電泳產物進行膠回收,則還需用75%酒精對器具進行消毒。 
2.配膠:根據基因組片段大小,配置相應濃度的瓊脂糖凝膠。**先將錐形瓶洗幹淨並加入少量純水煮沸,然後量取一定量的電泳緩衝液(1×TAE)**錐形瓶中,再稱取相應量的BIOWESTAGAROSE(西班牙瓊脂糖)倒入錐形瓶中,搖勻並用錫紙封口,**後放入微波爐煮,煮膠的過程中需注意安全,應適當搖勻,防止爆沸。煮好的凝膠需無氣泡、色澤均勻。 
將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中,待凝膠冷卻**65℃時,及時將凝膠倒入裝好的幹淨模具中。 
待凝膠完全凝固後,將凝膠小心轉移**4℃冰箱,冷凍30min,然後拔梳子。此時,凝膠需平整、不漏孔,可以用於電泳檢測。 
3.電泳準備:先將幹淨的電泳槽排放整齊並做好標記,然後把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央,膠孔的方向朝向負極(注意:①放凝膠前,需將膠托底部的凝膠抹幹淨,防止膠托在電泳槽中滑動;②此時,可順便觀察凝膠是否漏孔),再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩衝液(1×TAE)**剛好將凝膠淹沒。(注意保持桌麵衛生,防止緩衝液灑到桌麵) 
4.驗孔:用2ul 6×溴酚黃加入到每一個膠孔中,檢測凝膠膠孔是否漏孔。若不漏孔,則可在凝膠孔底部看到一條黃色條帶;若漏孔,則看不到條帶。(注意:驗孔完畢之後,需將凝膠固定在電泳槽中央) 
5.上樣:將樣品、6×溴酚黃按3:1的比例混勻,輕甩後按照規定的順序上樣,上樣順序應與電泳槽上的標記一致,**後點上一定量的Ladder。(注意:①上樣時**確保上樣順序正確無誤,樣品間不混淆,點樣後的空管子先放在電泳槽旁邊,用於核查;②點樣時不戳孔、不外漏、不溢出;③點樣時需小心槍頭不要碰到凝膠,以免凝膠挪動,若凝膠已經挪動,需等樣品完全沉到底部後,再固定凝膠) 
6.電泳:確認已經正確上樣後,雙手蓋上電泳槽蓋,接通ag娱乐app和電泳槽(注意:確認電極正確連接),設置電泳參數:電壓:120V,電流:400mA,時間:30min; 注意確認電極、電泳參數完全正確之後,**後按star 鍵開始電泳。 
7.染膠:電泳結束之後,帶上PE手套,小心滑出凝膠,把凝膠轉移到幹淨的PE手套上(注意:PE手套上應做好標記,確保樣品、電泳槽、PE手套的標記是一致),小心地將凝膠放入相應標記的EB染膠盤中,蓋上蓋子染30min。其中,染膠盤放在EB暗房中,EB染液的配方為:100ml 1×TAE + 5ul EB燃料。(注意:①配製EB染液和染膠時需戴上乳膠手套、PE手套,必要時可戴上口罩,染膠時動作要輕,防止濺起EB染液;②注意區分EB汙染區與非汙染區,防止EB汙染區向非汙染區擴散) 
8.凝膠成像:帶上PE手套,將凝膠從染膠盤中撈出,放在染膠時的那個PE手套上(注意:撈膠時需小心防止凝膠斷裂、滑落,盡量把多餘的EB染液甩幹),將凝膠放入凝膠成像係統中,按照“Tanon凝膠成像係統操作規程”進行操作拍照。(注意:拍照時需嚴格區分EB汙染區與非汙染區,防止EB汙染區汙染電腦、鍵盤及鼠標),**後保存膠圖信息**規定的文件夾內,命名規則為:日期+姓名+工號+部門+電泳銅人陣考核。