SDS-PAGE電泳標準操作流程介紹

3.程序: 
3.1. 製膠 
3.1.1組裝膠架   將潔淨、無水的玻片對齊,形成空腔,插入塑料框的凹槽中,注意箭頭向上,並確保下
端平齊。放於製膠架上夾緊,下端緊貼密封條。 
3.1.2 分離膠的配置     
3.1.2.1  10%分離膠配方如下表:

3.1.2.2 灌膠  混勻後用移液槍將凝膠溶液沿玻棒小心注入到長、短玻璃板間的狹縫內(膠高度距樣品模板
梳齒下緣約1cm)。  
3.1.2.3液封  在凝膠表麵沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔**空氣,使膠麵平整。靜置約30min觀察膠麵
變化,當看到水與凝固的膠麵有折射率不同的界限時,表明膠已完全凝固,倒掉上層水,並用濾紙吸幹殘留的水液。 
3.1.3濃縮膠的配置   
3.1.3.1  5%濃縮膠配方下表:

3.1.3.2插入製膠梳  
混勻後用移液槍將凝膠溶液注入到長、短玻璃板間的狹縫內(分離膠上方),輕輕加入樣品模板梳,小心避免氣泡的出現。約30分鍾,聚合完全。 3.2. 電泳 
3.2.1 安裝電泳槽  將製備好的凝膠板取下,小心拔下梳子。兩塊10%的凝膠板分別插到U形橡膠框的兩邊凹
形槽中,可往上提起使凝膠板緊貼橡膠。將裝好玻璃板的膠模框平放在仰放的貯槽框上,其下緣與貯槽框下緣對齊,放入電泳槽內。倒入1X tris-gly電泳緩衝液。 
3.2.2  樣品處理  對於蛋白樣品直接取80µl的樣品,依次加上20µl  5x buffer (加了B-巰基乙醇),混勻。
對於菌體或組織等固體樣品,取少量樣品加100ul 2x buffer (加了B-巰基乙醇)煮沸10分鍾。 
3.2.3  加樣    用移液槍取處理過的樣品溶液10μl,小心地依次加入到各凝膠凹形樣品槽內,marker 加
入到其中一個槽內,為區別兩塊板,marker可加在不同的孔槽中。 
3.2.4 電泳  將電泳槽放置ag娱乐app上,接通電源,正負極對好。電壓調**約150v保持恒壓。待溴酚藍標記移動到凝膠底部時,關電源,把電泳緩衝液倒回瓶中。 
3.2.5剝離膠  把電泳槽取出,兩塊板拿下來,用刮片從長短玻片中間翹起,再把濃縮膠刮掉,取下。 
3.3. 染色放於加有R250染色液的染色皿中,染液漫過膠即可,置於搖床上,轉速約為45r/min,時間約1小時,
完成後染液倒掉並用水洗掉染液。 
3.4.脫色取出染色過的膠放於加有脫色液的染缸裏,脫色液漫過膠即可,置於搖床上,轉速約為45r/min,時間約1小時,本底色脫淨,條帶清晰可見即可,完成後倒掉脫色液。 
3.5.拍照  將脫色後的膠置於透明文件夾中,把膠上麵的氣泡趕出(用前也可用酒精棉球擦幹淨文件夾),放到
掃描儀上,拍照。 
4. 注意事項 
4.1  根據目的蛋白的大小選擇合適的膠片濃度。一般為100KD-50KD選用10%膠;50KD-30KD選用12%膠;
30KD-10KD選用15%膠。4.2  要根據樣品濃度來加樣品溶解液。每加一個樣品後換一支吸頭或清洗吸頭後再點另一個樣品。4.3  製備聚丙烯酰胺凝膠時,倒膠後常漏出膠液,那是因為二塊玻璃板與塑料條之間沒封緊,留有空隙,所以這步要特別留心操作.4.4  電泳完畢撬板取凝膠時要小心細致不能把膠弄破。 4.5  電泳緩衝液可重複利用,如果膠上出現不正常痕跡,就要及時更換新液。4.6  分離膠高度控製得當,確保有大約1cm左右的濃縮膠空間。過長或過短均不能得到理想的電泳結果。4.7  電泳染色液注意進行回收再利用,一般可重複使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化劑,加入的量要合適,過少則凝膠聚合很慢甚**不聚合,過多則聚合過快,影響倒膠。
操作步驟: 
采用垂直式電泳槽裝置 1、 安裝電泳槽 
2、 配製分離膠(12%)(10ml): 

將分離膠上的水倒去,並用濾紙吸幹多餘水份,加入上述混合液,立即將梳子插入玻璃板間,完全聚合需15-30min。 4、待積層膠完全聚合後,小心拔出梳子,然後將玻璃板固定在電泳槽上。 
5、樣品處理:將樣品加入等量的2×SDS上樣緩衝液,100℃加熱3-5min, 12000g離心1min,取上清作SDS-PAGE分析,同時將SDS低分子量蛋白質Marker作平行處理。 
6、上樣:取10μl誘導與未誘導的處理後的樣品加入樣品池中,並加入20μl低分子量蛋白Marker作對照。 
7、電泳:在電泳槽中加入1電泳緩衝液,連接電源,電泳時,積層膠電壓80V,分離膠電壓120V,電泳**溴酚藍行**電泳槽下端停止(約需2-3h)。 
8、染色:將膠從玻璃板中取出,置於考馬斯亮藍染色液中染色,室溫4-6h。 9、脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色**蛋白帶清晰。