電泳技術概述淺談

電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團,它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電,在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術就是利用在電場的作用下,由於待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異,使帶電分子產生不同
的遷移速度,從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。
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    電泳過程**在一種支持介質中進行。Tiselius等在1937年進行的自由界麵電泳沒有固定支持介質,所以擴散和對流都比較強,影響分離效果。於是出現了固定支持介質的電泳,樣品在固定的介質中進行電泳過程,減少了擴散和對流等幹擾作用。**初的支持介質是濾紙和醋酸纖維素膜,目前這些介質在實驗室已經應用得較少。在很長一段時間裏,小分子物質如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、矽膠薄層平板為介質的電泳進行分離、分析,但目前則一般使用更靈敏的技術如HPLC等來進行分析。這些介質適合於分離小分子物質,操作簡單、方便。但對於複雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質的引入大大促進了電泳技術的發展,使電泳技術成為分析蛋白質、核酸等生物大分子的重要手段之一。**初使用的凝膠是澱粉凝膠,但目前使用得**多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺
凝膠。蛋白質電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。 
     電泳裝置主要包括兩個部分:電源和電泳槽。電源提供直流電,在電泳槽中產生電場,驅動帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種,常用於聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板,玻璃板兩邊由塑料條隔開,在玻璃平板中間製備電泳凝膠,凝膠的大小通常是12cm  14 cm,厚度為1mm~2? mm,近年來新研製的電泳槽,膠麵更小、更薄,以節省試劑和縮短電泳時間。製膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子,在膠聚合後移去,形成上樣品的凹槽。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩衝液,或將凝膠直接浸入緩衝液中。由於pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變,進而影響其電泳遷移的速度,所以電泳過程應在適當的緩衝液中進行的,緩衝液可以保持待分離物的帶電
性質的穩定。 
    為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的,下麵簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個平行電極上加一定的電壓(V),
就會在電極中間產生電場強度(E),L是電極間距離。
4 _$ P7 ^5 I5 H2 R/ F
 
    在稀溶液中,電場對帶電分子的作用力(F),等於所帶淨電荷與電場強度的乘積。這個作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動。在移動過程中,分子會受到介質粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質孔徑大小以及緩衝液粘度等有關,並與帶電分子的移動速度成正比,對於球狀分子,F’的大小服從Stokes定律,即:F’=6πrηυ式中r是球狀分子的半徑,η是緩衝液粘度,υ是電泳速度(υ= d / t,單位時間粒子運動的距離,cm / s )。當帶電分子勻速移動時: F = F’,q?E = 6πrηυ
由此可以看出,遷移率與帶電分子所帶淨電荷成正比,與分子的大小和緩衝液的粘度成反比。 
       用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量時,實際使用的是相對遷移率mR。帶電分子由於各自的電荷和形狀大小不同,因而在電泳過程中具有不同的遷移速度,形成了依次排列的不同區帶而被分開。即使兩個分子具有相似的電荷,如果它們的分子大小不同,由於它們所受的阻力不同,因此遷移速度也不同,在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴於分子所帶的電荷不同進行分離,如等電聚焦電泳;而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產生的阻力不同而得到分離,如SDS-聚丙烯酰胺
凝膠電泳。分離後的樣品通過各種方法的染色,或者如果樣品有放射性標記,則可以通過放射性自顯影等方法進行檢測。 
凝膠電泳的實驗原理 
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  聚丙烯酰胺凝膠電泳,普遍用於分離蛋白質及較小分子的核酸。瓊脂糖凝膠孔徑較大適用於分離同工酶及其亞型,大分子核酸等應用較廣。瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以製成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小範圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp**近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚**相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但製備和操作比瓊脂糖凝膠困難。
聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。  
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