影響電泳實驗結果的幾個因素簡述

若將帶靜電荷Q的離子置於電場中,它的受力簡單分析如下: 電荷引力:   F引=EQ 

根據Stokes公式,運動中的顆粒在溶液中受到阻力: F阻=6πrην 平衡時,有F引=F阻,即 EQ=6πrην 整理後得:ν=EQ/(6πrη) 

式中:E——電場強度;r——球形粒子的半徑;η——溶液的粘度係數;ν——帶電粒子運動速度。 

由上式可知,相同帶電顆粒在不同強度的電場裏泳動速度是不同的。為了便於比較,常用遷移率代替泳動速度表示粒子的泳動情況。遷移率為帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度。若以m表示遷移率:上式兩邊同時除以電場強度E,則得:m=Q/(6πrη) 

由於蛋白質、氨基酸等的電離α受溶液pH值影響,所以常用遷移率m和當時條件下電離度α的乘積即有效遷移率U表示泳動情況: U=m·α 代入m得:U=αQ/(6πrη) 

從上式可以看出,影響分子帶電量Q及電離度α的因素如溶液的pH、影響溶液粘度係數的因素如溫度、分子的半徑r等,都會影響有效遷移率。因此,電泳應盡可能在恒溫條件下進行,並選用一定pH的緩衝液。所選用的pH以能擴大各種被分離組分所帶電荷量的差異為好,以利於各種成分的分離。 

除以上因素影響電泳結果外,還有離子強度、電滲現象也對電泳構成影響。一般**合適的離子強度在0.02~0.20mol/L之間。離子強度過小會降低溶質的溶解度,離子強度過大會降低被分離組分的泳動速度並增加電泳過程中的發熱量,使區帶擴散變形。如果電泳不是在溶液中而是在支持介質中進行,還要注意選用無電滲或低電滲物質作支持物。所謂電滲是指在電場中,液體對於固體支持物的相對移動。電滲液流往往破壞電泳中已形成的區帶,使其擴散變形。 

綜上所述可知,電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH值、電滲及離子強度等多種因素的影響。當電泳結果欠佳時,應檢查或重新設計實驗條件以便改進。  

不同的帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同。常用泳動度(或遷移率)來表示。泳動度是指帶電顆粒在單位電場強度下泳的速度。 

影響泳動度的主要因素有: 

1、**先決定於帶顆粒的性質,即顆粒所帶淨電荷的數量,大小及形狀 

一般說來,顆粒帶淨電荷多,直徑小而接近於球形,則在電場中泳動速度快,反之則慢。泳動度還與分子的形狀,介質粘度,顆粒所帶電荷有關,泳動度與顆表麵電荷成正比,與介質粘度及顆粒半徑反比。帶電荷的高分子在電解質溶液中把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍,形成一離子擴散層。加以電場時,顆粒向符號相反的電極移動即帶陽電荷顆粒移向負極,帶陰電荷顆粒移向正移;離子擴散層由於帶有過剩的與顆粒符號相反的電荷,可以向相反方向移動。結果顆粒與離子擴散之間的靜電 引力使顆粒的泳動度減慢,另外,高分了顆粒表麵有一層水,在電場影響下,它與顆 粒一起移動,可以認為是顆粒的一部分。 

2、電場強度 

電場強度也稱電位梯度,是指單位長度(每一厘米)支持物體上的電位降,它對泳動度起著十分重要的作用。例如紙電泳。測量25厘米長紙條兩端電壓為250伏特,則電場強度為250伏特/25厘米=10伏特/厘米。 

一般,電場強度越高,帶電顆粒移動速度越快。根據電場強度大小,可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳,前者的電壓在100-500伏特,電場強度一般是2-10伏特/厘米;後者電壓可高達500-1000伏特,電場強度在200-2000伏特/厘米。常壓電泳分離 時間需數小時**數天,高壓電泳時間短,有時僅幾分鍾即可,高壓電泳主要用於分離氨基酸,肽,核苷酸,由於電壓升高,電壓也隨之增大,故需冷卻裝置。 

3、電滲作用   

在支持物的電泳中,影響電泳的另一個重要因素是電滲作用。所謂電滲就是指在電場中液體對固體支持物的相對移動,例如在pH8.6時,血清蛋白質進行紙電泳時,γ球蛋白與其他蛋白質一樣帶負電荷,應該向正極移動,然而它卻向負極方向移動,這就是電滲作用的結果。濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負電荷,如一束毛細管,進行電泳時蛋白質通過這些孔隙向前移動。紙的孔隙帶有負電荷,與帶電顆粒一樣可以吸引正離子,因此介質沿管壁相對地帶的較多的正電荷。在電場中,帶負電荷的蛋白質向正極移動,而介質卻向反向陰極移動,從而對蛋白質顆粒的泳動起阻礙作用。由於γ球蛋白分子顆粒大,淨電荷較少,移動速度慢,電滲作用大於顆粒向前泳動的力,結果γ球蛋白向後退。而其他血清蛋白質,因分子較小,淨電荷較多,電滲作用 小於分子向前移動的力,因此分子向前移。所以,血清蛋白質電泳後球蛋白反而在點樣位置之後。 

4、溶液的pH值 

溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度,也決定了物質所帶淨電荷的多少,對於蛋白質,氨基酸等兩性電解質而言,溶液pH值離電點越遠,顆粒所帶淨電荷越多;電泳速度越快;反之則越慢。例如血清中幾種主要蛋白質的等電點各不相同,白蛋白等電點是4.0。α2球蛋白等電點是5.06,β球蛋白等電點是5.1,γ球蛋白等電點是7.1。當在pH8.6的電泳緩衝液中電泳時,這些蛋白質都帶負電荷,它們的泳動速度是白蛋 白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此,當要分離一種蛋白質混合物時,應選擇 一種能擴大各種蛋白質所帶電荷量差異的pH值,以利於各種蛋白質分子的解離。同 時,為保持電泳過程中溶液pH恒定也須使用緩衝液。