凝膠電泳的注意事項概述

影響電泳別離的主要因素: 

1. 待別離生物大分子的性質:待別離生物大分子所帶的電荷、分子巨細和性質都會對電泳有顯著影響。通常來說,子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形,則其電泳搬遷速度越快。 

    2. 緩衝液的性質:緩衝液的pH值會影響待別離生物大分子的解離程度,從而對其帶電性質發生影響,溶液pH值間隔其等電點愈遠,其所帶淨電荷量就越大,電泳的速度也就越大,特別關於蛋白質等兩性分子,緩衝液pH還會影響到其電泳方向,當緩衝液pH大於蛋白質分子的等電點,蛋白質分子帶負電荷,其電泳的方向是指向正極。為了堅持電泳進程中待別離生物大分子的電荷以及緩衝液pH值的穩定性,緩衝液通常要堅持必定的離子強度,通常在0.02-0.2,離子強度過低,則緩衝能力差,但假如離子強度過高,會在待別離分子周圍構成較強的帶相反電荷的離子分散層(即離子氛),因為離子氛與待別離分子的移動方向相反,它們之間發生了靜電引力,因此導致電泳速度下降。另外緩衝液的粘度也會對電泳速度發生影響。 

    3. 電場強度:電場強度(V/cm)是每厘米的電位降,也稱電位梯度。電場強度越大,電泳速度越快。但增大電場強度會導致經過介質的電流強度增大,而構成電泳進程發生的熱量增大。電流在介質中所做的功(W)為:W=I2.R.t式中:I為電流強度,R為電阻,t為電泳時刻。 

  電流所作的功**大有些都轉換為熱,因此導致介質溫度升高,這會構成許多影響: 

1、 樣品和緩衝離子分散速度添加,導致樣品別離帶的加寬; 2、 發生對流,導致待別離物的混合; 3、 假如樣品對熱靈敏,會導致蛋白變性; 

4、 導致介質粘度下降、電阻下降等等。電泳中發生的熱通常是由中心向外周發出的,所以介質中心溫度通常要高於外周,特別是管狀電泳,由此導致中心有些介質相關於外周有些粘度下降,摩擦係數減小,電泳搬遷速度增大,因為中心有些的電泳速度比邊際快,所以電泳別離帶通常呈弓型。下降電流強度,能夠減小生熱,但會延長電泳時刻,導致待別離生物大分子分散的添加而影響別離效果。所以電泳實驗中要挑選恰當的電場強度,一同能夠恰當冷卻下降溫度以取得較好的別離效果。 

    4. 電滲:液體在電場中,關於固體支撐介質的相對移動,稱為電滲景象。因為支撐介質外表可能會存在一些帶電基團,如濾紙外表通常有一些羧基,瓊脂可能會富含一些硫酸基,而玻璃外表通常有Si-OH基團等等。這些基團電離後會使支撐介質外表帶電,吸附一些帶相反電荷的離子,在電場的效果下向電極方向移動,構成介質外表溶液的活動,這種景象即是電滲。在pH值高於3時,玻璃外表帶負電,吸附溶液中的正電離子,導致玻璃外表鄰近溶液層帶正電,在電場的效果下,向負極搬遷,股動電極液發生向負極的電滲流。假如電滲方向與待別離分子電泳方向一樣,則加速電泳速度;假如相反,則下降電泳速度。 

5. 支撐介質的篩孔:支撐介質的篩孔巨細對待別離生物大分子的電泳搬遷速度有顯著的影響。在篩孔大的介質中泳動速度快,反之,則泳動速度慢。  

關於膠收回切膠的一點注意事項: 

1. 電泳的buffer和gel都是新製的,切膠的台子整理潔淨,刀片**佳洗淨滅菌,總歸一句話即是確保切下的帶沒有外源dna汙染。 

2. 切膠是要把全部意圖片斷所在方位的膠全部收回。為了削減膠的體積,能夠用相對比較薄的膠來做,隻要夠點樣即可,也可采用薄而寬的梳子來跑膠。 3. 關於防護,在通常有機玻璃後就足夠了,戴上防護麵具以維護雙眼,假如戴樹脂眼鏡就能夠了。要是十分懼怕紫外照射,或許關於膠有特殊請求,例如請求不含EB,能夠采用點marker和帶刻度的尺子一同照相的方法來斷定意圖條帶在膠上的方位進行切膠。 

4. 依照正常程序點marker跑膠,然後切下有marker的膠,EB染色,紫外燈下與帶刻度的尺子一同照相。因為要收回的帶與marker間的相對方位已知,依據尺子來衡量未染色膠上意圖帶的方位即可。假如覺得很難判別,能夠直接在marker邊點少數的樣,這麽方位就簡單斷定了。

 

以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強度,可以減小生熱,但會延長電泳時間,引起待分離生物大分子擴散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當的電場強度,同時可以適當冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。 

    4. 電滲:液體在電場中,對於固體支持介質的相對移動,稱為電滲現象。由於支持介質表麵可能會存在一些帶電基團,如濾紙表麵通常有一些羧基,瓊脂可能會含有一些硫酸基,而玻璃表麵通常有Si-OH基團等等。這些基團電離後會使支持介質表麵帶電,吸附一些帶相反電荷的離子,在電場的作用下向電極方向移動,形成介質表麵溶液的流動,這種現象就是電滲。在pH值高於3時,玻璃表麵帶負電,吸附溶液中的正電離子,引起玻璃表麵附近溶液層帶正電,在電場的作用下,向負極遷移,帶動電極液產生向負極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同,則加快電泳速度;如果相反,則降低電泳速度。 

5. 支持介質的篩孔:支持介質的篩孔大小對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質中泳動速度快,反之,則泳動速度慢。