電泳 各物質作用簡述

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體,其凝固的好壞
直接關係到電泳成功與否,與促凝劑及環境密切相關; 
製膠緩衝液:濃縮膠選擇pH6.7,分離膠選擇pH8.9,選擇tris-HCL係統,具體作用後麵介紹; 
TEMED與AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固; 
十二烷基硫酸鈉(SDS):陽離子去汙劑,作用有四:去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。  tris中文品名: 三羥甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇; 緩血酸胺 
你要知道Tris是個很會吃酸的東西,1M的Tris能吃下很多很多的HCl,換句話說,你如果用0.1M的鹽酸調500ml Tris的pH,可能倒下整整一瓶的鹽酸都不夠,硬生生把原本500ml加到了800ml也說不定。 
電泳原理 
聚丙烯酰胺凝膠電泳是網狀結構,具有分子篩效應,它具有兩種形式,一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠,蛋白質在電泳中保持完整的狀態,蛋白在其中依三種因素分開:蛋白大小,形狀和電荷。  
  而SDS-PAGE僅根據蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術**先是1967年由shapiro建立,他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去汙劑和強還原劑後,蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。  
  SDS是陰離子去汙劑,作為變性劑和助溶試劑,它能斷裂分子內和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白分子的二、三級結構。而強還原劑如巰基乙醇,二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS後,分子被解聚成多肽鏈,解聚後的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白- SDS膠束,所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量,這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。  
  SDS-PAGE一般采用的是不連續緩衝係統,於連續緩衝係統相比,能夠有較高的分辨率。  
  濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮**一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩衝液,電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始後,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷,因此一起向正極移動,其中氯離子**快,甘氨酸根離子**慢,蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率**大,超過蛋白,因此在後麵形成低電導區,而電場強度與低電導區成反比,因而產生較高的電場強度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動,形成以穩定的界麵,使蛋白聚集在移動界麵附近,濃縮成一中間層。  
  此鑒定方法中,蛋白質的遷移率主要取決於它的相對分子質量,而與所帶電荷和分子形狀無關。   
電泳中常見現象 
哈哈,我做過這個論文哈! 
1. 配膠緩衝液係統對電泳的影響? 
      在SDS-PAGE不連續電泳中,製膠緩衝液使用的是Tris-HCL緩衝係統,濃縮膠是pH6.7,分離膠pH8.9;而電泳緩衝液使用的Tris-甘氨酸緩衝係統。在濃縮膠中,其pH環境呈弱酸性,因此甘氨酸解離很少,其在電場的作用下,泳動效率低;而CL離子卻很高,兩者之間形成導電性較低的區帶,蛋白分子就介於二者之間泳動。由於導電性與電場強度成反比,這一區帶便形成了較高的電壓剃度,壓著蛋白質分子聚集到一起,濃縮為一狹窄的區帶。當樣品進入分離膠後,由於膠中pH的增加,呈堿性,甘氨酸大量解離,泳動速率增加,直接緊隨氯離子之後,同時由於分離膠孔徑的縮小,在電場的作用下,蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。 
      所以,pH對整個反應體係的影響是**關重要的,實驗中在排除其他因素之後仍不能很好解決問題的情況,應**要考慮該因素。 2. 樣品如何處理? 
      根據樣品分離目的不同,主要有三種處理方法:還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 
      1)還原SDS處理:在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)後,蛋白質構象被解離,電荷被中和,形成SDS與蛋白相結合的分子,在電泳中,隻根據分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理,樣品稀釋適當濃度,加入上樣Buffer,離心,沸水煮5min,再離心加樣。 
      2)帶有烷基化作用的還原SDS處理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的並經久牢固的保護SH基團,得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT,而防止銀染時的紋理現象。100ul樣品緩衝液中10ul 20%的碘乙酸胺,並在室溫保溫30min。 
      3)非還原SDS處理:生理體液、血清、尿素等樣品,一般隻用1%SDS沸水中煮3min,未加還原劑,因而蛋白折疊未被破壞,不可作為測定分子量來使用。 
3. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用? 
      聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體,其凝固的好壞直接關係到電泳成功與否,與促凝劑及環境密切相關; 
      製膠緩衝液:濃縮膠選擇pH6.7,分離膠選擇pH8.9,選擇tris-HCL係統,TEMED與AP:AP提供自由基,TEMED是催化劑,催化自由基引起的聚合反應進行;十二烷基硫酸鈉(SDS):陽離子去汙劑,作用有四:去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。 4. 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑? 
      聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝膠的分辨率。建議做法:待凝膠在室溫凝固後,可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易導致凝固不充分,後者可導致SDS結晶。一般凝膠可在室溫下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。 
      一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料,不同染料又各自不同的染色方法,具體可參照郭堯君編著的《蛋白質電泳技術手冊》P82-103。 5.“ 微笑”(兩邊翹起中間凹下)形帶原因? 
      主要是由於凝膠的中間部分凝固不均勻所致,多出現於較厚的凝膠中。       處理辦法:待其充分凝固再作後續實驗。 6. “皺眉”(兩邊向下中間鼓起)形帶原因? 
      主要出現在蛋白質垂直電泳槽中,一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除幹淨。 
      處理辦法:可在兩板間加入適量緩衝液,以排除氣泡。 7. 為什麽帶出現拖尾現象? 
      主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 
      處理辦法:加樣前離心;選擇適當的樣品緩衝液,加適量樣品促溶劑;電泳緩衝液時間過長,重新配製;降低凝膠濃度。
8. 為什麽帶出現紋理現象? 
      主要是樣品不溶性顆粒引起的。 
      處理辦法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。 9. 什麽是“鬼帶”,如何處理? 
      “鬼帶”就是在跑大分子構象複雜的蛋白質分子時,常會出現在泳道頂端(有時在濃縮膠中)的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉澱,主要由於還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性,致使原來被解離的蛋白質分子重新折疊結合和亞基重新締合,聚合成大分子,其分子量要比目標條帶大,有時不能進入分離膠。但它卻於目標條帶有相同的**學活性,在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用。 
      處理辦法:在加熱煮沸後,再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇,以補充不足的還原劑;或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 10. 為什麽溴酚藍不能起到指示作用? 
       ag娱乐app在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底,但蛋白質卻還未跑下來的現象。主要與緩衝液和分離膠的濃度有關。 
      處理辦法:更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。 11. 為什麽電泳的條帶很粗? 
      電泳中條帶很粗是常見的事,主要是未濃縮好的原因。 
      處理辦法:適當增加濃縮膠的長度;保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7);適當降低電壓; 
12. 為什麽電泳電壓很高而電流卻很低呢? 
      這種現象一般初學者易出現。比如電壓50v以上,可電流卻在5mA以下。主要是由於電泳槽沒有正確裝配,電流未形成通路。包括:a.內外槽裝反;b.外槽液過少;c.電泳槽底部的**緣體未去掉(比如倒膠用的橡膠皮)。       處理辦法:電泳槽正確裝配即可。 
13. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎? 
      這主要出現在初學者中,一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致;後者是由於在解除製膠的夾子後,板未壓緊而致空氣進入引起的。 
14. 凝膠時間不對,或慢或快,怎麽回事?通常膠在30MIN-1H內凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS劑量不夠或者失效。APS應該現配現用,TEMED不穩定,易被氧化成黃色。 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量過多,此時膠太硬易裂,電泳時易燒膠。 15. 電泳時間比正常要長? 
      可能由於凝膠緩衝係統和電級緩衝係統地PH選擇錯誤,即緩衝係統地PH和被分離物質的等電點差別太小,或緩衝係統的離子強度太高。