電泳操作方法簡述

一、 目的 
建立SDS-PAGE電泳的測定方法,確保電泳檢測的準確性,保證電泳的安全性、有效性。  
二、 範圍與權責 
適用於本公司的所有成品以及中間體的分析,由化驗員負責采樣檢測。 品控主管負責審核。  
三、 原理 
SDS-PAGE電泳,是在聚丙烯酰胺凝膠係統中引進SDS,SDS會與變性的多肽結合,並使蛋白帶負電荷,由於多肽結合SDS的量總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關,因此SDS多肽複合物在丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率隻與多肽的大小有關,在達到飽和的狀態下,每克多肽可與1.4g去汙劑結合。當分子量在15KD到200KD之間時,蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關係,符合下式:lgMw=k-bX。式中:Mw為分子量;X為遷移率;k、b均為常數,若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對數分子量對數作圖,可獲得一條標準曲線,未知蛋白質在相同條件下進行電泳,根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。  
四、 實驗儀器及試劑 
1. DYCZ-24DN 雙垂直ag娱乐app 2. DYY-8C  ag娱乐app電源 
3. STS-2A  脫色搖床(水平) 4. 標準蛋白Marker 5. 平皿:直徑150mm 6. TEMED:四甲基乙二胺 7. DTT:二硫蘇糖醇 8. 
儲存液 
①2M Tris-HCl緩衝液:稱取24.2g Tris,用50ml蒸餾水溶解後,滴加HCl調節pH**8.8,待室溫,加蒸餾水**100ml。 
②1 M Tris-HCl緩衝液:稱取12.1g Tris,用50ml蒸餾水溶解後,滴加HCl調節pH**6.8,待室溫,加蒸餾水**100ml。 
③10%SDS溶液:稱取10g SDS ,加蒸餾水溶解**100ml。 ④50%甘油:50ml甘油加50ml蒸餾水,混合均勻。 
⑤1%溴酚藍:100mg溴酚藍,加蒸餾水**10ml,攪拌**完全溶解,水相針式過濾器過濾除去聚合的染料。 9.   工作液 
①A液:30%丙烯酰胺儲存液,丙烯酰胺是一種神經毒素,可通過皮膚被人體吸收並富集。操作時要避免皮膚接觸,並帶合適的口罩於通風櫥中進行。 
②B液—分離膠緩衝液:取75ml 2M Tris-HCl緩衝液,4ml10%SDS溶液,加21ml蒸餾水,混合均勻,4℃保存數月。 
③C液—濃縮膠緩衝液:取50ml 1M Tris-HCl緩衝液,4ml10%SDS溶液,,加46ml蒸餾水,混合均勻,4℃保存數月。 
④10%APS:稱取1g過硫酸銨,加10ml蒸餾水溶解後,水相針式過濾器過濾分裝到EP管中,4℃保存一個月,-20攝氏度保存一年。 ⑤上樣緩衝液:稱取0.154g DTT,於10ml容量瓶中,加少量水溶解後,加 0.6ml 1 M Tris-HCl緩衝液,5ml 50%的甘油,1ml 1%溴酚藍,混合均勻後定容**刻度線。 
可分裝**EP管保存,4℃保存一個月,-20攝氏度保存一年。 
⑥電極緩衝液:稱取3g Tris,14.4g Gly,1g SDS**1L燒杯中,加1L蒸餾水溶解,攪拌均勻,室溫保存。 
10.   染色液:稱取1g考馬斯亮藍R-250,加450ml乙醇,加100ml乙酸,加水450ml,混合均勻,室溫保存。 
11.   脫色液:100ml乙醇,加100ml冰醋酸,加水800ml,混合均勻,室溫保存。  
五、 操作步驟 
1、ag娱乐app的組裝 
   ①將平板玻璃和凹板玻璃重疊,用手將兩塊玻璃板在桌麵上或是玻璃板上豎起,使兩玻璃底麵平齊,從而形成膠室。 
   ②將膠室放入主體,是凹玻璃的一麵向內。若做單麵膠,另一側用單膠堵板(δ=5mm)代替。    ③插入楔形插板,用力向下按,擠緊玻璃板。 
   ④將主體放入原位製膠器內,手柄起立位與底座箭頭對齊,兩手同時把手柄向主體推動,直到推不動為止,然後開始旋轉手柄,聽到哢、哢兩聲,底座箭頭指向手柄1.0mm標誌處,此時楔形插板已壓緊膠室,可以開始灌膠了。 2、分離膠的配製 
按上表,將A液,C液,蒸餾水先加到小燒杯中,混合均勻,再添加10%APS,TEMED後,混合均勻,迅速連續灌到分離膠頂部,直**有膠溢出,隨即插入試樣格,在室溫或恒溫箱內垂直放置10min,靜置直**完全聚合。 4、樣品的處理 
   將樣品與上樣緩衝液以4:1混合均勻,在金屬浴上100℃,10min,如有沉澱,可適當離心備用。 5、加樣 
   ①在凝膠聚合後,向相反的方向擰手柄,手柄彈出。        ②將ag娱乐app主體從原位製膠器上取出放入ag娱乐app下槽中。 
   ③將約140ml的電泳緩衝液倒入由膠室和主體形成的上槽中,使緩衝液沒過凹玻璃板。 
④將約200ml的電泳緩衝液倒入下槽中 ⑤慢慢地將試樣格垂直拔出。 
⑥將處理好的標準蛋白和待測蛋白樣品,按預定順序通過緩衝液小心的添加5~10μl到每個樣品孔中。 6、電泳 
蓋好電泳槽蓋,接通ag娱乐app電源與ag娱乐app之間的電泳導線,設定電壓為60V,電泳時間約為30min,直**溴酚藍指示帶經過濃縮膠與分離膠的分界線後,設定電壓100v,電泳時間150min,直**溴酚藍指示帶接近分離膠底部,切斷電源,電泳完畢。 7、剝膠 
       卸下電泳膠板,用刮刀小心撬開玻璃板,使兩者分離,切除凝膠左下角以示標記。