瓊脂糖凝膠電泳的操作步驟

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。對於分子量較大的樣品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。 
  瓊脂糖凝膠約可區分相差100bp的DNA片段,其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低,但它製備容易,分離範圍廣,尤其適於分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的範圍為0.2-20kb,利用脈衝電泳,可分離高達10^7bp的DNA片段。
操作流程
  準備幹淨的配膠板和電泳槽 
  注意DNA酶汙染的儀器可能會降解DNA,造成條帶信號弱、模糊甚**缺失的現象。 
選擇電泳方法
  一般的核酸檢測隻需要瓊脂糖凝膠電泳就可以;如果需要分辨率高的電泳,特別是隻有幾個bp的差別應該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳;用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈衝凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。 
正確選擇凝膠濃度
  對於瓊脂糖凝膠電泳,濃度通常在0.5~2%之間,低濃度的用來進行大片段核酸的電泳,高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎,小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨,造成條帶缺失現象。 
適合的電泳緩衝液
  常用的緩衝液有TAE和TBE,而TBE比TAE有著更好的緩衝能力。電泳時使用新製的緩衝液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩衝液多次使用後,離子強度降低,PH值上升,緩衝性能下降,可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。 
電泳的合適電壓和溫度
  電泳時電壓不應該超過20V/cm,電泳溫度應該低於30℃,對於巨大的DNA電泳,溫度應該低於15℃。注意如果電泳時電壓和溫度過高,可能導致出現條帶模糊和不規則的DNA帶遷移的現象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象 
DNA樣品的純度和狀態
  是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現缺帶現象DNA樣品的純度和狀態注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現象。乙醇沉澱可以去除多餘的鹽,用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失,也可能出現不規則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱,用20mM NaCl緩衝液稀釋可以防止DNA變性。 
DNA的上樣
  正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊,而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚**缺失。TIANGEN公司DNA分子量標準每次上樣6ul即可得到清晰均勻的條帶。 
Marker的選擇
  DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的,這樣對目標片段大小的估計才比較準確。TIANGEN公司的DNA Marker條帶清晰,亮度均勻,質量穩定,是您實驗的**。需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker,需要預先65℃加熱5min,冰上冷卻後使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規則或條帶信號弱等現象。 
凝膠的染色和觀察
  實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙啶(EB),染色效果好,操作方便,但是穩定性差,具有毒性。而其他係列例如SYBR Green,GelRed,雖然毒性小,但價格昂貴。TIANGEN公司的GeneGreen相比則是性價比高的低毒替代染料,其靈敏度比傳統EB染料高10倍以上。注意觀察凝膠時應根據染料不同使用合適的光源和激發波長,如果激發波長不對,條帶則不易觀察,出現條帶模糊的現象。
 

步驟如下:
1. 製備1%瓊脂糖凝膠(大膠用70ml,小膠用50ml): 稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置於錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次**瓊脂糖全部融化,搖勻,即成1.0%瓊脂糖凝膠液.
2. 膠板製備:取電泳槽內的有機玻璃內槽(製膠槽)洗幹淨,晾幹,放入製膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好,形成模子.將內槽置於水平位置,並在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個玻璃板表麵形成均勻膠層.室溫下靜置直**凝膠完全凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中.添加 
1×TAE電泳緩衝液**沒過膠板1-2㎜為止.
3. 加樣:在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩衝液,上樣緩衝液的**終稀釋倍數應不小於1X.用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內,每加完一個樣品,應更換一個加樣頭,以防汙染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠麵.(注意:加樣前要先記下加樣的順序).
4. 電泳:加樣後的凝膠板立即通電進行電泳,電壓60-100V,樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動.電壓升高,瓊脂糖凝膠的有效分離範圍降低.當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時,停止電泳.
(5)電泳完畢後,取出凝膠,用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE溶液染色約20 min,再用清水漂洗10 min.
(6)觀察照相:在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像係統拍照保存.