電泳技術原理、分類及分析方法

電泳法,是指帶電荷的供試品(蛋白質、核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中,於電場的作用下,向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動,使組分分離成狹窄的區帶,用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其百分含量的方法。
電泳技術的基本原理和分類
在電場中,推動帶電質點運動的力(F)等於質點所帶淨電荷量(Q)與電場強度(E)的乘積。F=QE質點的前移同樣要受到阻力(F)的影響,對於一個球形質點,服從 Stoke定律,即:F′=6πrην式中r為質點半徑,η為介質粘度,ν為質點移動速度,當質點在電場中作穩定運動時:
F=F′即 QE=6πrην
可見,球形質點的遷移率,**先取決於自身狀態,即與所帶電量成正比,與其半徑及介質粘度成反比。除了自身狀態的因素外,電泳體係中其它因素也影響質點的電泳遷移率。
電泳法可分為自由電泳(無支持體)及區帶電泳(有支持體)兩大類。前者包括 Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區帶電泳則包括濾紙電泳(常壓及高壓)、薄層電泳(薄膜及薄板)、凝膠電泳(瓊脂、瓊脂糖、澱粉膠、聚丙烯酰胺凝膠)等。
自由電泳法的發展並不迅速,因為其ag娱乐app構造複雜、體積龐大,操作要求嚴格,價格昂貴等。而區帶電泳可用各種類型的物質作支持體,其應用比較廣泛。本節僅對常用的幾種區帶電泳分別加以敘述。
影響電泳遷移率的因素
⒈電場強度 電場強度是指單位長度(cm)的電位降,也稱電勢梯度。如以濾紙作支持物,其兩端浸入到電極液中,電極液與濾紙交界麵的紙長為 20cm,測得的電位降為 200V,那麽電場強度為200V/20cm=10V/cm。當電壓在500V以下,電場強度在 2-10v/cm 時為常壓電泳。電壓在 500V 以上,電場強度在20-200V/cm 時為高壓電泳。電場強度大,帶電質點的遷移率加速,因此省時,但因產生大量熱量,應配備冷卻裝置以維持恒溫。
⒉溶液的pH值 溶液的pH決定被分離物質的解離程度和質點的帶電性質及所帶淨電荷量。例如蛋白質分子,它是既有酸性基團(-COOH),又有堿性基團(-NH2)的兩性電解質,在某一溶液中所帶正負電荷相等,即分子的淨電荷等於零,此時,蛋白質在電場中不再移動,溶液的這一pH值為該蛋白質的等電點(isoelctric point,pI)。若溶液pH處於等電點酸側,即pH<pl,則蛋白質帶正電荷,在電場中向負極移動。若溶液pH處於等電點堿側,即pH>pl,則蛋白質帶負電荷,向正極移動。溶液的pH離pl越遠,質點所帶淨電荷越多,電泳遷移率越大。因此在電泳時,應根據樣品性質,選擇合適的pH值緩衝液。
⒊溶液的離子強度 電泳液中的離子濃度增加時會引起質點遷移率的降低。其原因是帶電質點吸引相反符合的離子聚集其周圍,形成一個與運動質點符合相反的離子氛(ionic atmosphere),離子氛不僅降低質點的帶電量,同時增加質點前移的阻力,甚**使其不能泳動。然而離子濃度過低,會降低緩衝液的總濃度及緩衝容量,不易維持溶液的 pH值,影響質點的帶電量,改變泳動速度。離子的這種障礙效應與其濃度和價數相關。可用離子強度 I表示。
⒋電滲 在電場作用下液體對於固體支持物的相對移動稱為電滲(electro-osmosis)。其產生的原因是固體支持物多孔,且帶有可解離的化學基團,因此常吸附溶液中的正離子或負離子,使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持物時,紙上纖維素吸附OH 帶負電荷,與紙接觸的水溶液因產生H3O+,帶正電荷移向負極,若質點原來在電場中移向負極,結果質點的表現速度比其固有速度要快,若質點原來移向正極,表現速度比其固有速度要慢,可見應盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。
電泳分析常用方法
(一)醋酸纖維素薄膜電泳
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。由該物質製成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質樣品吸附性小,幾乎能完全消除紙電泳中出現的“拖尾”現象,又因為膜的親水性比較小,它所容納的緩衝液也少,電泳時電流的大部分由樣品傳導,所以分離速度快,電泳時間短,樣品用量少,5μg 的蛋白質可得到滿意的分離效果。因此特別適合於病理情況下微量異常蛋白的檢測。
醋酸纖維素膜經過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理後可使膜透明化有利於對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。
⒈材料與試劑 醋酸纖維素膜一般使用市售商品,常用的電泳緩衝液為pH8.6 的巴比妥緩衝液,濃度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要點
⑴膜的預處理:**於電泳前將膜片浸泡於緩衝液,浸透後,取出膜片並用濾紙吸去多餘的緩衝液,不可吸得過幹。
⑵加樣:樣品用量依樣品濃度、本身性質、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質的常規電泳分析,每 cm加樣線不超過1μl,相當於60-80μg的蛋白質。
⑶電泳:可在室溫下進行。電壓為25V/cm,電流為0.4-0.6mA/cm寬。
⑷染色:一般蛋白質染色常使用氨基黑和麗春紅,糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff 試劑,脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
⑸脫色與透明:對水溶性染料**普遍應用的脫色劑是5%醋酸水溶液。為了長期保存或進行光吸收掃描測定,可浸入冰醋酸:無水乙醇=30:70(V/V)的透明液中。