RNA凝膠電泳試驗

實驗基本原理
RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進行檢測。在非變性電泳中,可以分離混合物中不同分子量的RNA分子,凡是無法確定分子量。隻有在變性情況下,RNA分子完全伸展,其泳動率才與分子量成正比。
判斷RNA提取物的完整性是進行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA製品的電泳圖譜應可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶,且28s rRNA的亮度應為18s rRNA的兩倍。
實驗試劑
1、0.1%DEPC水:200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻,室溫放置過夜,高壓滅菌。
2、10x電泳緩衝液:嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)0.4mol/L(pH 7.0);NaAc 0.1mol/L;乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L;
3、50mL變性瓊脂糖凝膠(1%):10x電泳緩衝液5 mL;瓊脂糖0.5 g;0.1%DEPC水36.5 mL;加熱溶解,稍冷卻,加入8.5 ml 37%甲醛。
4、上樣緩衝液(染料):50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4% 溴酚蘭,0.4%二甲苯藍。
5、甲酰胺(去離子)。v電泳槽清洗:去汙劑洗幹淨(一般浸泡過夜)——水衝洗——乙醇幹燥——3%H2O2灌滿——室溫放置10分鍾——0.1%DEPC水衝洗。
操作步驟
1、將製膠用具用70%乙醇衝洗一遍,晾幹備用。
2、製膠:稱取0.5g瓊脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水(蒸餾水40ml)的錐形瓶中,加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷(60~70°)卻後加入5ml的10x電泳緩衝液、8.5(9)ml的甲醛(+0.5μl溴化乙錠)。然後在膠槽中灌製凝膠,插好梳子,水平放置待凝固後使用。
3、加樣:在一個潔淨的小離心管(DEPC處理過的500μl的)中混合以下試劑:電泳緩衝液(10x)2μl、甲醛3.5ml、甲酰胺10ml(μl)、RNA樣品3.5(4.5)μl。混勻,置60℃保溫10min,冰上速冷。加入3μl的上樣緩衝液(染料)混勻,取適量加樣於凝膠點樣孔內。同時點RNA標準樣品。
4、電泳:打開ag娱乐app(電泳槽內加入1XMOPS緩衝液),穩壓7.5V/cm(ml)電泳。
5、電泳結束後通過紫外透視儀觀察。
注意事項
本實驗中**保持RNase汙染以免RNA降解。所有試劑用DEPC水配製,用具也用DEPC水衝洗,並滅菌。
①電泳RNA所用器械如製膠的模具、梳子、電泳槽等用肥皂粉洗幹淨後用雙蒸水衝洗二遍後在室溫晾幹備用。
②用新的1XTBE配製1.2%瓊脂糖凝膠,倒膠時溴化乙錠(EB)直接加入凝膠中。
③製備好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽後再加入經高壓滅菌過的1XTBE,液麵隻能剛好同膠麵平齊,緩衝液不要淹過膠麵。
④點樣時,樣品RNA每10μl加入2μl上樣緩衝液,上樣緩衝液是用DEPC處理的水配製的50%甘油,另外單獨點一樣品孔含有3μl溴酚藍的上樣緩衝液作為電泳指示劑,電泳電壓4V/cm,電泳時間2h左右便可取出凝膠在紫外燈下觀看所提取的RNA的質量或進行拍照記錄。