Western-blotting:SDS-PAGE和免疫印跡

Western-blotting:SDS-PAGE和**印跡
一:蛋白質的提取
1、取出細胞,倒去培養液,用PBS洗滌細胞一次,充分除去PBS液體,把細胞置於冰上。配置細胞裂解液,細胞裂解液用滅菌水配置,然後按照1:100比例加入PMSF混勻,然後按照細胞的多少加入裂解液於培養瓶中,在冰上放置20min。在此期間每隔3-5min搖晃培養瓶,讓其充分裂解細胞。
2、裂解結束後,吸取裂解液於另一隻1.5ml離心管中,於4℃13000r/min 離心15min。
3、離心結束後,吸取離心管內上清於另一隻幹淨離心管中。於-20℃保存。
4、根據上樣量的多少,計算需要處理的樣品,在處理樣品時按照1:1比例加入2×buffer。於100℃煮5-10min。結束後短暫離心,於4℃備用。
二、主要試劑的配製:
1、30%丙烯酰胺溶液:取29.2g丙烯酰胺,0.8g甲叉雙丙烯酰胺,加水**100ml,過濾,棕色瓶內避光4℃保存;
2、1.5M Tris-HCl分離膠緩衝液,pH8.8 (4x):取18.15g Tris,用1M HCl調pH**8.8,加水**100ml,4℃保存;
3、1.0M Tris-HCl在濃縮膠緩衝液,pH 6.8(8x):取12g Tris,用1M HCl調pH**6.8,加水**100ml,4℃保存;
4、電極緩衝液:pH8.3( 1x):取28.8g甘氨酸,6.04g Tris堿,加10ml 10% SDS,加水**1L,室溫保存;
5、10% SDS溶液:取10g SDS,加水**100ml,完全溶解後室溫保存。
6、10%過硫酸銨溶液(APS):取0.1g過硫酸銨,加水**1ml,每次用前新鮮配製
7、2X樣品緩衝液 0.1M TrisCL,PH6.8;0.2M DTT;4%SDS;2%溴酚蘭 ;20%甘油
8、電轉印液 pH 8.2-8.3: 甘氨酸 14.42g,Tris base 3.02g,dH2O 800ml,甲醇 200ml, 1N HCL調定pH值**8.2-8.3,室溫放置 。
9、考馬斯亮藍染色液:考馬斯亮藍R-250 0.25g,甲醇 45ml ,dH2O 45ml,加入冰乙酸10ml, 過濾後使用。
10、脫色液:1號脫色液:甲醇250ml冰乙酸 50ml 加dH2O定溶**500ml; 2號脫色液:甲醇 100ml,冰乙酸 75ml,加dH2O定容**1000ml
11、抗體稀釋液:1%BSA/PBS。
12、封閉液:2.5-5%脫脂奶粉
三、電泳
1、配置12% SDS-PAGE凝膠電泳
2、配電泳槽,配5%濃縮膠:水 5.5ml,30%丙烯酰胺 1.3ml,1M Tris(PH6.8)1.0ml,10%SDS 0.08ml,取其中1ml與10%APS0.1ml及TEMED4ul混合,封電泳槽,其餘備用。
3、配12%分離膠:水 6.6ml,30%丙烯酰胺 8.0ml,1.5M Tris(PH8.8)5.0ml,10%SDS 0.2ml,10%APS 0.2ml,TEMED0.008ml混合,灌膠。小心覆蓋一層液體(75%乙醇)。
4、膠凝後,棄掉覆蓋層液體,在濃縮膠中加 10%APS0.08ml,TEMED4ul混合灌膠,在插梳子時小心避免氣泡。
5、開始所加電壓為80V,**溴酚藍進入分離膠,將電壓升**120V,溴酚藍到達分離膠底部約0.5cm ( 4—5h左右),電泳完畢,關閉電源。取下凝膠,一塊用於考馬斯亮藍染色,另一塊用於轉印。
6、凝膠考馬斯亮蘭染色
a. 待溴酚蘭指示劑到達分離膠下沿約0.5cm時,關掉電源,傾去緩衝液,取下膠塊置於染色盒染色。
b. 染色:在染色盒內倒入染色液,37℃染色3─5h(或室溫過夜)。
c. 脫色:用脫色液浸泡,**好能夠振搖,換2-3次脫色**背景無色。
d. 凝膠成像保存:用凝膠成像係統將脫色後的凝膠掃描成像保存。
3. **轉印:
3.1 小心拆開電泳裝置,將膠切角以空位,並將之浸入100ml轉移buffer平衡15min。
3.2 推薦預先配好電泳buffer並置於4℃以使之充分去除氣體。
3.3 切出比膠稍大的PVDF,在與膠對應處切角作記號。
3.4 以100%甲醇濕潤膜15sec,然後轉入dH2O中浸潤2min。
3.5 轉入轉印buffer中平衡5min以上。
3.6 組裝轉印三明治,它由多孔墊片、濾紙(一層)、PVDF、膠、濾紙、多孔墊片組成。
3.7 合上轉印盒子,插入轉印電泳槽,凝膠麵對向負極。
3.8加入足量buffer以45V電壓4℃轉印18-20hr。
3.9 轉印結束後,取出膜並使之幹燥,以增強蛋白質結合,室溫晾幹30min。
4.**雜交:(均在室溫、振搖條件下進行)
4.1晾幹後的膜在2.5%脫脂奶粉-PBS(或者用封閉液)中封閉2 hr。
4.2以PBS洗膜2次×5分鍾。
4.3稀釋一抗於1%BSA/PBS中與膜孵育1小時。
4.4PBS洗膜15分鍾一次,以後再洗4次×5分鍾。
4.51%BSA/PBS稀釋HRF-標記的二抗並與膜孵育1小時。(其他顯色方法)
4.6洗膜:同步驟4。
4.7溶液A與B各0.5毫升等體積混合後,振搖條件下與膜共育1分鍾。注意:避光條件下操作。
4.8吸除過量的化學發光試劑,將膜包裹於保鮮膜中。
4.9在暗盒中曝光X片30秒,衝洗膠片,根據結果調整**適曝光時間。