Westernblot基本流程與經驗交流

Westernblot基本流程
1.蛋白處理:此步驟是**,蛋白處理的好否決定結果好壞。取細胞,3000rpm 3min離心,加入含蛋白酶抑製劑(現做現加)的細胞裂解液(本實驗室選擇RIPA,1×106/L細胞對應100ul),槍尖反複吹吸裂解細胞(此步非常重要,容易出現鼻涕樣的液體,此為裂解不充分的緣故,所以應反複吹打或者置於振蕩器上,直**鼻涕狀液體消失)。冰上放置**少半小時。
2.煮蛋白:12000rpm,15min離心,吸取上清,加入Loading buffer後於沸水中煮5min後,放於-80保存。
3.清水洗玻璃板,無水酒精擦洗幹淨,夾膠圈,防止漏膠。
4.配製10%分離膠,加入垂直板中,再加入1ml水液封(加入TEMED立即搖勻加入,加水液封時要緩慢些,防止把膠衝變形)。
5.20分鍾後,把上清水倒掉,用濾紙把剩餘的水吸幹。配製5%濃縮膠(按1.5倍體積配液,保證足量),立即加入分離膠上層(**不能出現空泡),立即插梳子。10-20分鍾後等膠凝固。
6.準備樣品及marker、loading buffer,如果樣品是之前保存的,則應再次煮沸5min。
7.將含膠的玻璃板裝入電泳槽內,加入電極緩衝液(**好是新配製的),保證玻璃板內的液麵高於玻璃板外。拔出梳子,拿注射器將每個加樣孔吹一次,把其中可能存在的碎膠吹走,避免影響加樣。
8.上樣:本人上樣有2個習慣。1.上樣**快些,如果上樣時間超過半個小時以上,可能會出現孔中樣品彌散出來。
2.每個孔均加40ul:樣品40ul,Marker加完後再加Loading40ul,非上樣孔上loading buffer40ul,保證整塊膠重量平衡
9.電泳:本人采用恒流電泳,一塊膠10mA(兩塊則20mA),等染料進入分離膠後,電流加大**20mA,總共約3-3.5h,電泳時周圍可放置冰塊,起到電泳槽散熱的效果。
10.準備好電轉液,濾紙、PVDF膜或者NC膜。電泳結束後,取下凝膠,Marker處做標誌。上下各四層濾紙(5×8cm),下膜(5.5×8.5cm),上膠,本人用半幹轉移儀,電流設置為1塊膠45mA,轉移3.5h。(注意:1.濾紙、膜**經過電轉液浸泡,PVDF膜還得甲醇浸泡 2.上下濾紙之間不能有接觸,避免短路 3.膜與膠之間不能有氣泡 4. 正反極一定得正確,否則蛋白就轉移到濾紙上了)
11.封閉:5%脫脂牛奶室溫封閉2h或者4度封閉過夜
12.洗膜:含0.1%Tween-20的PBS洗滌三次,每次5min(提高Tween-20濃度可以去背景)
13.孵育一抗:室溫2小時或者4度過夜。**好一次孵育**多兩張膜,太多的膜可能一抗結合效果不佳。
14.洗膜:同前
15.孵育二抗:室溫一小時(時間過長不宜),不推薦4度過夜
16.洗膜:同前
17.壓片:具體步驟不贅述。注意點如下:1.壓片時間得由ECL液中顯影強度決定,短則2-10秒,長則2-5min
2.一般同時壓2--4張片子,**底下那張一般太黑沒法用。所以我**底下那張一般不換,壓其他的膜也用這張做**底下一張,可以節省膠片
18.壓過的膜還可以重新洗膜後孵育新的一抗、二抗。

這就是自己做Westernblot的一般流程,其中犯過很多錯誤,尤其是一些注意點其實都是自己的出錯的地方。寫出此貼,也是希望能幫助更多的朋友初步學習Westernblot,其中有不對的地方還希望大家批評指正。