Western Blot實驗步驟

實驗步驟:
1.分別配製 5%濃縮膠和12%分離膠
      12%分離膠10mL     5%積層膠6mL
H2O   3.3mL   H2O   4.20mL
30% Acrylamide   4mL   30% Acrylamide   1mL
pH8.8 Tris HCl(1.5M)  2.5mL   PH6.8Tris HCl(1M) 0.76mL
10%APS   100uL   10%APS   60uL
10%SDS   100uL   10%SDS   60uL
TEMED   7.6uL   TEMED   6uL

分離膠:分離膠配製完畢即可進行灌膠,灌膠結束後使用ddH2O進行液封。當水和膠之間有一條折射線時,說明膠已經凝好。(一般要等1.5h)
積層膠:倒掉分離膠上層的水並用吸水紙吸幹,配製積層膠並進行灌膠,插入梳子。積層膠凝固完全後拔掉梳子,準備上樣電泳。(一般凝固0.5h以上)

2.電泳:
上樣順序如下:
細胞裂解液15ul  細胞裂解液15ul  預染蛋白Marker 10uL 細胞裂解液15ul 細胞裂解液15ul
  
電泳條件:90V 1.5h 。

3.轉印:
電泳結束後,取出膠,剪相應大小的一張硝酸纖維素膜和六張濾紙,將膠、膜、濾紙和海綿放入轉印緩衝液中浸透,取夾子,按照“海綿—三層濾紙—膠—硝酸纖維素膜—三層濾紙—海綿”的順序安裝好,每一步都要避免產生氣泡,放入轉印裝置中,使膠靠近負極,膜靠近正極。
轉印條件:90mA, 90min。

4.封閉:
膜片置於封閉液(PBS / 5%脫脂奶粉)中,4℃過夜封閉。
取出膜PBST洗三次,每次洗 5 min。

5.一抗孵育:
稀釋液為1%的PBS脫脂奶粉
一抗(鼠抗)稀釋500倍(說明書上為500-1000倍)。70r/min,室溫孵育3h。
PBST洗3次,每次8 min。

6.二抗孵育:
稀釋液為1%的PBS脫脂奶粉
使用AP標記的羊抗小鼠的二抗,稀釋約30000倍。70r/min,室溫孵育2h。
PBST洗3次,每次8 min。

7.顯色
按照以下配方配製NBT/BCIP顯色液:
NBT原液:NBT 40mg 加0.7%的DMF 1.2mL混勻,4℃避光保存(用鋁箔包裹);
對照、待測NBT,各配一組。
BCIP原液:BCIP 20mg加100%的DMF 1.2mL混勻,4℃避光保存(用鋁箔包裹)。
顯色緩衝液:0.1M Tris HCl ,0.1M NaCl ,50mM MgCl2,pH 9. 5。

使用時BCIP和NBT各10uL加在1mL緩衝液中,EP管中混勻,滴到膜上,避光處顯色,5~10分鍾。見條帶後,水洗,中止顯色。

如果是DAB顯示的話,其他步驟一樣,就是**後一步顯示,按照DAB顯示試劑盒要求操作就可以了。