westren blot

Western Blot詳解-主要試劑
主要試劑
1、 丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺,應以溫熱(以利於溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配製含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g,N,N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g,加H2O**100ml。)儲於棕色瓶,4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0,因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月,隔幾個月須重新配製。如有沉澱,可以過濾。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去離子水配製,室溫保存。
3、 分離膠緩衝液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。
4、 濃縮膠緩衝液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶於40mlH2O中,用約48ml 1mol/L HCL調**pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。這兩種緩衝液**使用Tris堿製備,再用HCL調節PH值,而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N,N,N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時,聚合反應受到抑製。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所**的自由基。去離子水配製數ml,臨用前配製.
6、 SDS-PAGE加樣緩衝液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩衝液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,巰基乙醇3.2ml,0.05%溴酚藍1.6ml,H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合,在沸水終煮3min混勻後再上樣,一般為20-25ul,總蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸電泳緩衝液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸餾水溶解**1000ml,得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩衝液。臨用前稀釋10倍。
8、 轉移緩衝液:配製1L轉移緩衝液,需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS,並加入200ml甲醇,加水**總量1L。
9、 麗春紅染液儲存液:麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水**100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用後應予以廢棄。
10、 脫脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒,戴手套操作),溶於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。
12、 Tris緩衝鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 過氧化物酶標記的第二抗體。
15、 NBT(溶於70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。
16、 BCIP(溶於100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA。