關於western的一點兒小感觸,和大家分享下~

**近的一個月時間裏,開始我的實驗,因為在本科的時候生物技術試驗的時候都是按照試驗書上一步步的做,等於沒有接觸過真正的實驗,所以做western幾乎是從頭學起的。
以下是我自己這一個月的收獲,希望對大家有所啟示:
1.蛋白樣本的製備:因為我提取的是大鼠的海馬組織,自己覺得腦組織因為比較軟,所以用塑料研磨棒(而且高壓後還能重複利用)就OK,不用勻漿振蕩器就行。而相比較心肌組織比較硬,可以考慮用那個。如果說有的同學覺得上樣的時候樣本的溶解度不好,可以在上樣前在沸水中再重新煮一下(5分鍾),或者是在離心機上小轉一下。這樣蛋白溶解會好很多。
2.關於製備分離膠和濃縮膠:這點真是深有感觸啊,有的同學總抱怨抗體不給力,殊不知製備膠的過程在整個實驗占著非常重要的地位,大家可以參考自己的蛋白分子量選擇分離膠和濃縮膠的濃度,以及根據膠槽的大小選擇分離膠和濃縮膠的毫升數。自己覺得還是在37度溫箱裏等待膠凝固比較好,比室溫效果好。PS:一定不能心急,要各等待30分鍾。否則膠沒有完全凝固好,對電泳的影響會非常大~
3.關於蛋白上樣量,如果自己的蛋白濃度比較高,我的蛋白濃度一般都是30多微克每毫升,所以我試過20,15,10微升的上樣量,覺得10微升就足夠了。而且因為上樣量少,抗體如果比較少,結合相對來說會更好。
4.關於電泳:我的目的蛋白分子量是72KD,所以我一般是總共電泳100分鍾差不多,等待**後分離膠裏麵內參完全跑開再停止電泳。之前拖尾現象也遇到過,自己分析是製膠的時候沒有等待膠完全凝固好所致,或者是蛋白的溶解度不好的關係。調整之後,就比較好了。另外電泳液在兩塊玻璃板之間**好用新的。
5.關於轉膜:自己摸索了5次之後,覺得75分鍾是**好的轉膜時間,膠上的條帶會充分的轉到PVDF膜上。而且不會轉過頭。另外趕氣泡的時候一定注意看膠和PVDF膜之間是不是接觸好了。
6.關於封閉:我自己試過37度脫脂牛奶搖床上搖一個小時和4度脫脂牛奶過夜兩種,覺得後者比較好。
7.關於抗體:因為訂的是**產抗體,所以一抗都是用完之後不再重複利用,但是二抗保存在—20度還能再用一次。試過一抗4度過夜和37度搖床兩小時,可能是我的抗體在37度的溫度中發揮效應比較好,目的蛋白都是在37度搖床兩小時這種操作方法中出的,和傳統的4度過夜不太一樣。我也不知道具體原因。
8.關於ECL顯色:一般我是曝光3分鍾,5分鍾和8分鍾的效果比較好。

以上就是自己的一點兒小心得,希望大家一起批評指正~