暗室實驗(化學發光底物檢測方法)及Western Blot實驗優化方法

暗室實驗
暗室實驗的操作流程:
1. 新鮮配製1-2ml工作液(A液與B液1:1或1:40混合配製)
2. 進入暗室,在黑暗的條件下,加入1μl未稀釋的二抗(HRP連接物)
3. 混合後,可立即在暗室中觀察到藍色光



暗室實驗的注意事項:
工作液按正確比例混合,且新鮮配製
在暗室中加入二抗
直接使用未稀釋的二抗
加入二抗後,立即觀察
注:暗室實驗可同時檢測底物是否有活性,以及二抗是否有活性。

如果暗室實驗結果陰性:
更換其它二抗,再次進行檢測;再次檢測結果仍為陰性,證明底物喪失活性。

暗室實驗結果陽性:
認為二抗及底物活性良好; Western Blot 係統需要進一步優化
優化抗原和抗體濃度的斑點雜交方法:斑 點 雜 交 方 法——優 化 抗 原 和 抗 體 濃 度

對於一個給定的抗原,**佳的抗體濃度依賴的抗原和抗體本身。抗原和抗體的親和力,以及一抗與二抗的特異反應都是不同的。**優抗原和抗體濃度可通過**印跡實驗中使用不同濃度的抗原和抗體作用確定。另外,更快和更簡單的方法是進行斑點印跡實驗。以下是使用超敏感信號底物進行的斑點印跡的操作方法。
注:所有的抗體稀釋度假定起始濃度為1 mg/mL。
1. 用TBS 和PBS 稀釋的蛋白樣品,好的稀釋方法是由樣品中的抗原稀釋濃度決定的,但是由於抗原的濃度是未
知的, 所以有必要進行寬範圍的稀釋度的檢測。SuperSignal West Pic 化學發光底物的檢測靈敏度可達皮g 水平,所以樣品的稀釋範圍可以從微克水平到皮克水平。如果要使用過多的抗原,結果會出現以下情況:非特異性條帶、模糊條帶和信號降低。
2. 準備轉印膜。所需膜的數量依賴於被屏蔽的一抗和/或二抗有多少種不同稀釋濃度。通常,一種或兩種一抗的稀
釋度是用兩種或三種不同的二抗稀釋度進行測定的。例如:1/1000 的一抗和1/50000 的二抗;1/1000 的一抗和1/100000 的二抗;1/5000 的一抗和1/50000 的二抗;以及1/5000 和1/100000 的二抗。
3. 將膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點在膜上。用盡可能小量的稀釋液點在膜上(2-5 ul 為宜),因為用的體積越大,信號越彌散。抗原溶液在膜上幹10-30 分鍾或直**無可見的水分。
4. 用含0.05%的Tween-20 封閉液封閉膜上的非特異性點,室溫震蕩孵育1 h。
5. 將一抗稀釋到封閉液/Tween-20 去汙劑中,並加到膜上,室溫震蕩孵育1h。
6. 用TBS 或PBS 洗膜4-6 次,用盡可能大體積的洗脫液,在洗脫液中加入0.05%的吐溫,用以減少非特異背景。每次洗脫過程中,使膜懸浮在洗脫液中震蕩大約5 分鍾,倒出洗脫液並重複。孵育前,在洗脫液中短時間的漂洗可能會增加洗脫效率。
7. 製備二抗/HRP 結合的封閉試劑/Tween-20 去垢劑稀釋液,將二抗稀釋液加到膜上震蕩孵育1 h。
8. 按第6 步方法再次清洗膜。
9. 準備底物工作緩衝液,混合等體積的魯米諾/增強劑和穩定的過氧化物溶液。製備足夠體積確保印跡點完全濕潤,保證印跡點在孵育過程中不會幹。推薦體積:0.1 ml/cm2印跡麵。
10. 將膜在超感應顯色底物工作液中孵育5 分鍾;
11. 將膜從底物上移除,放到塑料布或其它防護膜上;
12. 將印跡貼到膠片上,在蛋白旁邊曝光。任何標準的或者增強的放射自顯影膠片都可以用。推薦**次曝光30-60 s,為得到**佳結果,曝光時間可不同。另外,也可用CCD 相機或其它成像設施;然而這些設施可能需要更長的曝光時間。
13. 在**佳的印跡膜上,超感應反應底物產生的信號可能會持續超過8 h。未獲得**佳結果,印跡能重複曝光到膠片上或者成像係統中。隨印跡時間的延長,需延長曝光時間。如果未得到**佳結果,可用抗原和/或抗體稀釋液重複進行這個程序。