Western blot 實驗技巧精要

Western blot 實驗技巧精要
——輕鬆獲得高質量 western blot 條帶圖
 
Western blot 方法在 SCI 文章中出現的頻率非常高,漂亮的 WB 電泳圖可以給文章增色不少。但是 WB 實驗的步驟瑣碎,細節頗多,要想得到令人滿意的結果還是需要花費很多時間和精力去摸索實驗技巧的。
 
小編經過了一段時間的努力,已經可以比較輕鬆的實現用 WB 方法對磷酸化蛋白計算藥物的 IC50 值(見下圖)。
    
 
接下來,小編將結合自己的經驗以及網上可以搜索到的 WB 實驗技巧,為大家介紹一下 WB 實驗過程中的**點。雖然 WB 實驗步驟很多,但隻要抓中其中的幾個重點方麵,就可以得到幹淨、漂亮、清晰、客觀的電泳圖。
 
一、 樣品準備部分
小編認為,ag娱乐app不應該太過重視 WB 電泳部分的操作技巧,樣品準備才是整個 WB 實驗中**重要的一個環節(沒有之一)。否則 WB 電泳技術再高也無法得到好的結果。小編認為以下 3 點值得大家重點關注:
 
1. 注意孵育、終止時間
如果想得到漂亮的梯度條帶,無論是不同處理時間的樣品,還是不同給藥濃度的樣品,在處理過程中都一定要嚴格按照設計的時間來孵育和終止,尤其是對於磷酸化蛋白,哪怕 1 秒也不要提前或耽擱。
 
2. 抑製蛋白降解
這是樣品製備中**需要注意的部分。抑製樣品蛋白降解的方法主要有兩種:
 
(1) 使用蛋白酶抑製劑
小編使用的是羅氏公司(Roche)的蛋白酶抑製劑 Cocktail 片劑,效果不錯。再與 PMSF 共同使用,可以很好地抑製蛋白降解。
 
(2) 全程低溫操作
提前預冷 PBS、裂解液甚**槍頭等,從收集細胞開始一直到煮樣的全過程都應該盡可能的保持在冰上操作。小編除了使用冰盒,大多數操作都是在 4℃冷房中進行的,雖然有點麻煩和辛苦,但是效果非常好。
 
3. 裂解液用量
將收集好的細胞加入裂解液進行裂解在操作上是非常簡單的,所以這一步的重要性很容易被大家忽視。裂解液的用量直接決定了細胞裂解程度以及裂解後的蛋白濃度。
 
如果加入的裂解液不足,蛋白濃度太高,會造成與上樣緩衝液反應不充分,電泳後會出現多條條帶,條帶形狀也不好。小編做磷酸化蛋白檢測時為了在每個膠孔中盡可能多上樣,所以用體積較少的裂解液製備了濃度很高的蛋白,結果就得不償失了(見下圖)。

 
這種情況的補救方法是給樣品繼續補加上樣緩衝液,煮樣,再跑膠。直接給已經煮過樣的樣品補加上樣緩衝液再煮樣,跑膠後的效果也會好很多(見下圖)。
 
如果加入的裂解液過多,蛋白濃度太低,會導致在膠孔中的上樣量不足,條帶不清晰。
那麽加入多少體積的裂解液**好呢?小編認為,加入細胞團體積的 10 倍體積的裂解液是一個比較好配比,當然也可以根據目標蛋白進行調整。
 
二、 WB 電泳部分
得到了高質量的樣品就已經很接近成功了,小編接下來為大家介紹一些 WB電泳部分的注意事項。
 
1. 製膠
小編建議大家直接用製膠試劑盒,價格不貴,質量不錯。如果自己配置母液,就請注意 pH 值。
 
製膠部分**重要的是在配濃縮膠前不要著急將分離膠上麵的水棄掉,先配好濃縮膠,在加 TEMED 之前再棄掉水。小編雖然沒有親自試過,但是如果棄掉水後 5 分鍾之內還沒有加上濃縮膠,這塊膠**好還是不要用了。
 
2. 上樣
小編的經驗是上樣的總蛋白量一般是 20-70ug,這個要根據檢測蛋白的含量而定,需要摸索。
 
計算後每個樣品的上樣體積如果比較小,用槍頭直接上樣是完全可以的,如果上樣量超過 20ul,**好還是用微量注射器來上樣。上樣確實是需要多多練習和體會的,上樣技術高可以多上 10ul 樣品而不溢出。
 
如果需要上樣的體積太大,也可以先上一部分,然後跑幾分鍾電泳,再停下來繼續上樣,這是完全可以的,經過下一步的調整,是不會影響效果的。
 
3. 電泳
每個孔的上樣量參差不齊沒關係,在樣品還沒有達到分離膠時用≤60V 的電壓可以很好的將樣品排列整齊,不容易跑出弧線或者不齊的線。
 
當樣品達到分離膠後,通常會改成 100V 繼續電泳,小編認為如果時間充足,電壓低一點效果不錯。
 
請注意:電壓改一次就好,不要多次調整。
 
4. 轉膜
在轉膜環節小編認為**重要的,也是**容易被大家忽視的一步是:預冷電轉液。大家一定感覺到過,電轉液加入甲醇後溫度會迅速上升,所以建議跑上電泳就配電轉液,加入甲醇後放入 4℃冰箱預冷。