western 顯影常見現象、原因及解決方案

Western 熒光檢測取決於抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—顯影和定影效率這一係統。我的經曆認為確保萬無一失的做法是如果看到熒光則壓 10~30s,看不到則同時壓兩張,10~30 min 洗一張,如果無則再補一張,1 h 後洗。再無,則壓過夜。共 3 張片,根據每次結果調整。
 
其中兩張片子的壓法如下描述: 先剪一張比膜長 2~3 厘米的片子(以供貼膠帶),然後剪 2 片細小透明膠帶貼到片子的左右兩邊(貼時膠帶留一半用於粘到封口膜上),然後將片子壓到膜上,並使透明膠帶留出的一半粘到封口膜上。這樣就固定了**張膠片,就不會因為放、取第二張膠片而使**張移動了。然後放第二張膠片,與**張片子貼在一起就行,注意片子要幹燥,壓片前用紙擦幹封口膜,以避免被底物液體汙染導致與下麵一張粘在一起。取時用手輕輕拂過就可以把上麵片子與下麵一張錯開了,不要用手摳,否則下麵一張也移動了。 在洗下麵一張片子時一定要取掉粘在片子上的膠帶,否則在膠帶的地方會影響顯影。熒光經過下麵一張膠片會稍微有些衰減,所以下麵一張膠片感光稍微比上麵一張強一些。
 
現象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解決
反影 (白色條帶, 黑色背景) ---- -- -1 HRP 過高 (背景較高) - - - - - - - - ---- - - - **少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 1
顯影後膜上條帶處變為黃色---- - -2 HRP 過高 (敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 2
信號弱或無---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP 過高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗體-抗原係統敏感性過低- --- - - - - - - 提高抗體濃度/蛋白上樣量*注 4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 轉膜不充分/過轉- -- -- - - -- - - - - ---- -優化轉膜條件*注 5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP 或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----測試活性或選用敏感底物 *注 6
高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP 過高 (背景較高) - -- - - - - - - - - - -- **少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封閉時間不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延長封閉時間 4 度過夜**好*注 8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗體與封閉液有交叉----- - - - - - - - - - -更換封閉液 (如 3%BSA 的 TBST)*注 9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST 洗脫不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脫時間、次數、用量*注 10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光時間過長 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光時間*注 11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗體濃度過高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗體濃度或蛋白上樣量*注 12
條帶內無顯影的白點----------------13 轉膜不良(如有氣泡在膠-膜之間) -- -- 精細操作*注 13
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂汙染- - - - - - - - - - - 按說明書平衡膜/戴手套用平頭鑷子持膜*注 14
---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜與 X 光片間有氣泡- -- - - - - - - - - - --顯影前去除氣泡*注 15
非特異性條帶- - - - - --------- -- - -16 抗體交叉反應- - - - - - - - - - - -- -- - --**少成倍稀釋一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 16
- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS 非特異性結合蛋白條帶 - - --- - ---使用無 SDS 轉膜液*注 17
散在小圓斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封閉液有雜質顆粒- -- - --------- ------- 靜置牛奶使大顆粒沉澱,僅用上層*注 18
 
*注 1 其具體問題有二:一是背景較高, 二是沒有條帶. 形成機製為條帶處 HRP 很快將底物耗竭,則不發光不使膠片感光而為白色, 周圍因背景 HRP 較低而持續發光一段時間使膠片感光為黑色。這種常見於高濃度抗體並且封閉/洗脫不好的情況下。如果沒有背景則就是原因 3 的現象。在暗室可以看到條帶周圍熒光而條帶處為暗。如是則要麽通過降低抗體解決,要麽動作迅速早期未耗竭底物時壓片,否則一旦耗竭通過減少壓片時間不能解決問題。也可以過一段時間鼿 RP 稍減後重加底物迅速壓片。還有另外一種反影現象就是壓出條帶粗大模糊,但條帶中心是空的白色,原因和上麵的一樣,主要是條帶中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的熒光帶,但與上麵的區別主要在於特異性要好一些,若繼續發展則就是原因 3 的現象。其分析和解決同上。
 
*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的產物使膜發黃, 壓出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的現象同時存在,隻是一種現象,在壓過的膜可以看出來(隻在加底物後一段時間出現,幾小時後可能還會消退,有時甚**剛加底物 1~2 min 就可以看出來,所以要把握時機)。如果沒有達到原因 1 和原因 3 的程度,那麽這種情況一定能夠看到很強的熒光,是一種良好的狀態, 是ag娱乐app所期盼的。如果壓出正常片子而不出現原因 1 和原因 3 的現象, 可以不予處理。但因為熒光太強極易導致條帶增粗變大,所以也可以不稀釋抗體而通過調整壓片時間來解決,一般壓 10s~30s,甚**可以 3~5s,即時根據結果在暗室調整, 熒光持續時間長的話都可連續壓十數張片子而效果良好。但也有這種情況,就是由於 HRP 過強無論怎麽減少壓片時間條帶都依然粗大(如果時間過短如<3s則可因感光不足導致條帶太淡,這樣就不可取了,但依然是粗大的、非條帶的本來麵目),那麽如果想獲得漂亮條帶則**通過降低抗體濃度(減少上樣量很不穩定且能力有限,故很少使用)來解決。原因1和3若如是則解決也是一樣的。