Western Blot 中隱藏的生化危機:抗體選擇

Western Blot 又稱為蛋白質印跡,是分子生物學、生物化學和**遺傳學中常用的基於抗體抗原之間特異**反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

其基本原理為:聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離,分離後的蛋白被轉移到固相支撐物(雜交膜)上,抗體特異性識別目標蛋白,通過酶促反應或者化學發光等方法將目標蛋白可視化,從而對蛋白進行定性或者定量研究。

抗體與抗原之間的特異性識別是 Western Blot 實驗中**為**的一個步驟,選擇的抗體是否合適、抗體的質量優劣都關乎實驗的成敗。下麵將從高品質抗體的選擇、驗證數據對抗體的重要性及內參抗體的選擇標準等方麵給大家一些建議。

質量是甄選**抗體的**要標準

2015 年,刊登在 Nature 的一篇文章深度闡述了目前抗體試劑的現狀與問題,給全**科研工作者敲響了警鍾。當抗體試劑遭遇信任危機,ag娱乐app更應深刻反思:如何才能獲得高質量、合適的抗體試劑。(查看全文)

市麵上常見的抗體有進口**、**產**、進口****內分裝這幾種類型。大部分進口**在抗體的質量、特異性、效價及保存條件方麵較有保障。而有些**產**的抗體,在做 Western Blot 時,由於其特異性不高,導致實驗結果出現背景不幹淨,非特異性條帶多等問題。進口****內分裝則是個別經銷商從廠家買到產品後,再通過稀釋、分裝、重新貼牌之後賣給客戶,這樣的抗體雖然價格相對便宜,但質量良莠不齊,批間差異較大。

要確保抗體的高質量,ag娱乐app通常是選擇可信賴的**,此外,還應注意抗體的供應商渠道是否正規,其供應鏈物流是否專業。綜合這幾方麵因素,Sigma-Aldrich 都是不錯的選擇。Sigma-Aldrich 是**內**早實行電子商務的生命科學產品供應商,並以直銷為主導,避免了中間流通環節的問題,加上其強大的物流體係,很大程度上降低了銷售環節可能帶來的實驗風險。

完善的驗證數據是抗體選擇的必要參考

**抗體還應具備完善的驗證數據和詳細的信息標注,比如:是否明確標注其可以用於 Western Blot、是否有足夠的數據支持證明該抗體適用於某一組織或者樣本、是否有明確的抗體建議稀釋濃度、該抗體的識別位點是連續的氨基酸序列的一級結構還是非連續性氨基酸的三維結構位點……這些信息和數據的真實性及完整性是保證 Western Blot  實驗順利進行的**。

關於這一點,HPA 金標抗體及其所提供的數據是一個很好的案例。HPA 抗體數據庫覆蓋了人類 85% 的蛋白,每支抗體均通過嚴格的抗原序列篩選及親和層析純化流程,確保其特異性和純度。此外,每支抗體在多種組織樣品中經過蛋白芯片、Western Blot、**組化、**熒光等實驗的驗證,並獲得學術委員會的認證。作為重要的參考數據,所有的實驗驗證、發表文獻和生物信息學預測都公布在 proteinatlas.org 網站供大家免費查詢。完善的實驗數據支持可避免因信息不完整而造成的選擇錯誤。

有效的內參抗體是實驗準確的重要憑證

在 Western Blot 中,內參是由持家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),在各組織和細胞中的表達相對恒定,在檢測蛋白的表達水平變化時常用來做參照物。借助內參校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差,是證明 Western Blot 實驗結果真實可靠的重要憑證。一些常見的內參基因及抗體包括 β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin 等。

值得注意的是,不同的內參抗體隻適用於一定範圍的樣本和組織,ag娱乐app需要查閱參考文獻,並根據樣本和組織的差別選擇合適的內參抗體,以確保實驗的準確性。(如下表所示)

內參抗體選擇標準 參考依據(貨號為 Sigma 公司推薦)
根據目的蛋白種屬來源 哺乳動物:GAPDH(G8795)、β-actin(A5441)、β-tublin(T2200)
植物:Plant actin(A0480)、Rubisco(R8000)
目的蛋白分子量大小 一般同內參相差5kDa
目的蛋白的定位 核定位蛋白:Lamin B(L9393)、TBP、Histone H3(H9289),PCNA(WH0005111M2)
膜定位蛋白:Na/K ATPase(A276)
線粒體定位蛋白:VDAC1/膜孔蛋白(AV35122) 、COX IV
胞質定位蛋白:GAPDH、β-actin、β-tublin (同樣適用於全細胞樣品檢測)
特異性及具體實驗目的 β-actin 在肌肉組織中含量很少
細胞增殖實驗中,c-Jun 由於自身表達變化就不適合做內參
凋亡檢測時,不適宜選擇LaminB、TBP 等作為內參

在 Western Blot 中如果抗體選擇或使用不當,可能會造成無信號、弱信號、高背景、有雜帶等實驗問題,下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案,供參考。

實驗問題 原因 解決方案
無信號或信號弱 一抗不純或特異性低 重新選擇或製備高特異性的抗體,純化抗體
抗體不工作 設置對照,分別檢查一抗、二抗是否能正常工作;檢查一抗及二抗種屬來源及亞型,正確選擇抗體
抗體濃度低,孵育時間短 增加抗體孵育時間;降低洗滌強度。
背景高 一抗濃度高 優化抗體濃度,推薦使用單抗
二抗濃度高 增加抗體的稀釋倍數
非特異性條帶 一抗不純或特異性低 重新選擇或製備高特異性的抗體,純化抗體
二抗非特異性 隻設置二抗對照,評估二抗影響
反影或條帶為黃色 二抗濃度高 增加抗體的稀釋倍數