Western Blot 中隱藏的生化危機 II:樣品製備

Western Blot 又稱為蛋白質印跡,是分子生物學、生物化學和**遺傳學中常用的基於抗體抗原之間特異**反應的一種定量或定性檢測蛋白的實驗方法。

其基本原理為:聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質樣品分離,分離後的蛋白被轉移到固相支撐物(雜交膜)上,抗體特異性識別目標蛋白,通過酶促反應或者化學發光等方法將目標蛋白可視化,從而對蛋白進行定性或者定量研究。

「良好的開始是成功的一半」,尤其對於生物學實驗,如果沒有高質量的實驗樣本,等待ag娱乐app的很可能是失敗的實驗結果。**特異的蛋白樣品對 Western Blot 實驗**關重要。下麵將從蛋白樣品製備的方法和試劑選擇上給大家一些建議,同時也和大家分享一些因蛋白樣品製備不當而導致 Western Blot 實驗失敗的案例。

蛋白樣品製備的基本原則

目的蛋白因其物種來源和組織特異性的不同,在種類和性質上有很大差異,因此並沒有一種製備方法可以適用於所有蛋白的提取。這就需要ag娱乐app進行全麵的分析後才能選擇**合適的蛋白製備方法,在這個過程中遵循的一個基本原則是「知己知彼」。

**先,「知己」是要了解:樣品是來自什麽物種?目的蛋白定位在哪種組織或細胞器?是可溶蛋白還是不可溶蛋白?是高豐度蛋白還是低豐度蛋白?在製備時需要保持蛋白的天然活性,還是需要變性蛋白?

其次,「知彼」是要知道:哪種方法或試劑能夠防止蛋白降解、聚集、沉澱、變性、修飾?哪種能夠去除高豐度蛋白幹擾,富集低豐度蛋白?哪種能去除核酸、多糖、脂肪等雜質?哪種能在有限的實驗條件下,簡便快速地獲得高純度且完整性好的蛋白?

遵循「知己知彼」的原則對蛋白樣品製備進行全麵分析,就能明確蛋白樣品製備的合適方法或試劑。

細胞組織裂解液的選擇

裂解液是**普遍使用的蛋白提取試劑,可根據文獻或經驗自行配製,也可購買商業化的產品。常見的細胞裂解液有 NP40、Triton X-100、RIPA buffer 等。下表是根據目的蛋白的不同定位選擇裂解液的建議。雖然裂解液的使用範圍比較廣泛,能夠滿足總蛋白的提取,但是無法做到特異蛋白的提取,特別是遇到低豐度蛋白或者活性蛋白功能分析時,通用型的裂解液存在很大的局限性。

樣品類型 裂解液(Sigma-Aldrich)
全細胞 NP-40或RIPA(貨號:R0278)
細胞質(可溶) Tris-HCl(貨號:T3253)
細胞質(細胞骨架) Tris-Triton(貨號:X100)
細胞膜結合部分 NP-40(貨號:NP40)或RIPA
細胞核 RIPA或核裂解液
線粒體 RIPA或線粒體分離試劑

蛋白抽提試劑盒的選擇

蛋白抽提試劑盒的出現彌補了細胞裂解液的應用局限性,特別是針對難提取的樣本或者亞細胞器蛋白的提取,例如:針對植物、動物組織/細胞、細菌、酵母等不同樣品及細胞核、細胞膜、線粒體、葉綠體、溶酶體等不同亞細胞器的專業提取試劑盒。這類特化試劑盒能夠針對目的蛋白的不同來源和不同組織定位進行裂解和提取, 簡化實驗操作的同時還能提高蛋白提取的得率。

以 Sigma 公司的 CelLytic?係列蛋白提取試劑盒為例:一方麵,該係列試劑盒有非變性的裂解配方,可**大程度地保留蛋白活性;另一方麵,該係列產品無需經過反複凍融、超聲破碎等傳統物理裂解方法,並能在很短時間內得到高純度的蛋白。如:膜蛋白提取試劑盒(CE0050),通過非變性裂解配方,隻需 20-30 分鍾即可得到具有天然活性的多層跨膜蛋白,且能夠有效地去除多糖、核酸等雜質。

此外,Sigma 公司還提供一係列從生物樣品中去除高豐度蛋白,富集低豐度蛋白的解決方案。Seppro? 係列產品通過與多種雞來源 IgY 多克隆抗體的**親和吸附作用,可將樣品中的蛋白質進行高度特異性的區分,從而達到富集低豐度蛋白的目的。它可以從人類的血清或血漿樣品中去除 14 種高豐度蛋白。此外,Seppro?產品線還能覆蓋對小鼠和大鼠樣品的處理,以及從植物樣品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。該類解決方案能顯著降低樣品的複雜性,利於低豐度蛋白的下遊檢測。

Western Blot 中的蛋白樣品危機

在 Western Blot 中如果蛋白樣品製備不當,可能會造成無信號、弱信號、條帶大小不正確等實驗問題。下表就此類實驗問題給出案例分析和解決方案,供參考。

實驗問題 原因分析 解決方案
無信號、弱信號 樣品中不含待檢測蛋白 確定目的蛋白的定位,優化蛋白提取方法
樣品蛋白含量低 去除高豐度蛋白,富集低豐度目的蛋白(產品:Seppro/ProteoPrep)
上樣量低 增加電泳上樣量
蛋白降解 添加合適的蛋白酶抑製劑或磷酸酶抑製劑
條帶大小不正確 蛋白具有多種剪接體 查閱文獻或通過搜索數據庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
蛋白存在二聚體或者多聚體 增加上樣前煮沸變性時間
多帶現象 細胞傳代次數過多,使其蛋白表達不同 使用原始未傳代的細胞株,做對照實驗
蛋白具有多種修飾形式 是否存在糖基化、磷酸化、羥基化?
去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯後的修飾
蛋白樣本降解 冰上操作,避免汙染,確保加入蛋白酶抑製劑
條帶扭曲、拖尾、有垂直紋理 蛋白樣品溶解度不好 優化蛋白提取方法,尋找合適的裂解液