操作篇:western blot 之發光鑒定

一般使用辣根過氧化物酶 HRP-ECL 發光法或堿性磷酸酶 AP-NBT/BICP 顯色法。

1.HRP-ECL 發光法:

將 A、B 發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸幹,反貼法覆於 A、B 混合液滴上,熄燈**可見淡綠色熒光條帶(5 min 左右)後濾紙貼角吸幹,置於保鮮膜內固定於片盒中,迅速蓋上膠片,關閉膠盒,根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1~2 min,清水漂洗一下後放在定影液中**底片完全定影,清水衝淨晾幹,標定 Marker,進行分析與掃描。

2.AP-NBT/BICP 顯色法:

每片 NBT/BICP 可溶解於 30 ml 水中,使用前將一片分裝在 30 個 EP 管中,每張 3×9 cm 的膜取一管配成 1 ml 即可。將 PBST 或 TTBS 洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗,濾紙貼角吸幹,反貼法覆於 NBT/BICP 溶液液滴上,並用不透明物體(如報紙)遮擋光線,顯色 20 s 後每 10 s 觀察一次,**條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗後放濾紙上晾幹即可觀察與掃描。

注:背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關,當然如果暴光時間長達半小時,出現背景是正常的。