操作篇:western blot 之封閉及雜交

封閉及雜交

在做雜交時,個人建議:還是使用雜交袋進行一抗和二抗的孵育,這樣節約抗體。

操作開始:

1. 將膜用 TTBS 從下向上浸濕後,移**含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動封閉 1 h。必要時可先用麗春紅染色(2%乙酸,0.5%麗春紅的水溶液)觀察蛋白條帶,再用去離子水和 TTBS 將麗春紅洗脫後封閉,如用蛋白 marker 則可省略此步。

2. 將一抗用 PBST 稀釋**適當濃度(在 1.5 ml 離心管中);撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪於實驗台麵上,四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整;將抗體溶液加到保鮮膜上;從封閉液中取出膜,用濾紙吸去殘留液後,將膜蛋白麵朝下放於抗體液麵上,掀動膜四角以趕出殘留氣泡;室溫下孵育 1~2 h 後,用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min。

3. 同上方法準備二抗稀釋液並與膜接觸,室溫下孵育 1~2 h 後,用 TBST 在室溫下脫色搖床上洗兩次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min,進行化學發光反應。