操作篇:western blot 之 轉膜

轉膜篇

1. 轉一張膜需準備 6 張 7.0~8.3 cm 的濾紙和 1 張 7.3~8.6 cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套,因為手上的蛋白會汙染膜。將切好的硝酸纖維素膜置於水上浸 2 h 才可使用。

要**:

(1)用鑷子捏住膜的一邊輕輕置於有超純水的平皿裏,要使膜浮於水上,隻有下層才與水接觸。這樣由於毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水裏,膜與水之間形成一層空氣膜,這樣會阻止膜吸水;

(2)個人感覺其實轉膜之前浸濕一下就 ok 了,沒有多大問題,可能按照上述操作結果會更好。

2. 在加有轉移液的搪瓷盤裏放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

3. 將夾子打開使黑的一麵保持水平。在上麵墊一張海綿墊,用玻棒來回擀幾遍以擀走裏麵的氣泡。在墊子上墊三層濾紙,一手固定濾紙一手用玻棒擀去其中的氣泡。

要**:

(1)「用玻棒來回擀幾遍以擀走裏麵的氣泡」,要**:一手擀另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。

(2)「在上麵墊一張海綿墊」要**:可三張紙先疊在一起在墊於墊子上。個人感覺就墊 1 張濾紙也沒問題。

4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反複撬。撬一會兒玻璃板便開始鬆動,直到撬去玻板。

除去小玻璃板後,將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋於濾紙上,用手調整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒擀去氣泡。將膜蓋於膠上,要蓋滿整個膠(膜蓋下後不可再移動)並除氣泡。

在膜上蓋 3 張濾紙並除去氣泡。**後蓋上另一個海綿墊,擀幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行,要不斷的擀去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸後會發生短路。

要**:

(1)「要在兩個邊上輕輕的反複撬」要**:應該邊撬邊用流水緩緩衝洗

(2)「直到撬去玻板」要**:撬時一定要小心,膠很易裂,要用巧勁

(3)轉移液含甲醇,操作時要戴手套,實驗室要開門以使空氣流通。

(4)**後做成的「三明治」千萬不能形成短路,不然有可能會短路燒壞轉膜裝置(價格不菲,尤其是進口的),**次做的應請老手指教。

5. 將夾子放入轉移槽槽中,要使夾的黑麵對槽的黑麵,夾的白麵對槽的紅麵。電轉移時會產熱,在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用 60 V 轉移 2 h 或 40 V 轉移 3 h。

要**:

(1) 實際上應該根據蛋白分子量的大小確定轉膜時間,對於小分子量的蛋白,轉膜時**好墊兩塊硝纖膜,以免轉膜過頭。

因為如果**張膜上蛋白質已經轉過了,第二張膜上還有蛋白質可以進行檢測;對於大分子量的蛋白,轉膜時電壓要高一點,一般 80-100 V,時間也要延長一點,開始**好也用兩塊膜,特別是務必注意加強降溫措施。當然轉膜是要摸條件的,**好剛開始做的時候摸個轉膜的時間梯度。如果由於時間原因來不及做下麵實驗,可以在 4 度下 12V 轉膜過夜

(2) 硝纖膜建議使用 0.22 μm 的小孔徑膜,不容易轉膜過頭;

(3) 不同的轉膜裝置,轉移效率是不一樣的,所以換用轉膜裝置,**好再摸個條件

(4) 轉膜時電極方向注意是膜正膠負。

6. 轉完後將膜用 1×麗春紅染液染 5 min(於脫色搖床上搖)。然後用水衝洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。 將膜晾幹備用。(一般不需要做這步)