操作篇:western blot 之 SDS-PAGE 電泳

電泳篇開始

一、清洗玻璃板

一隻手扣緊玻璃板,另一隻手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩麵都擦洗過後用自來水衝,再用蒸餾水衝洗幹淨後立在筐裏晾幹。

二、灌膠與上樣

1. 玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠。

注意:可以用 1% 瓊脂糖在垂直電泳槽的左. 右和下部封邊,五分鍾後重複一次,這樣可以保證基本不漏膠。

2. 按前麵方法配 10% 分離膠,加入 TEMED 後立即搖勻即可灌膠。灌膠時,可用 10 ml 槍吸取 5 ml 膠沿玻璃放出,待膠麵升到綠帶中間線高度時即可。然後膠上加一層水,液封後的膠凝的更快。

注意:灌膠時開始可快一些,膠麵快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要慢,否則膠會被衝變型。

3. 當水和膠之間有一條折射線時,說明膠已凝了。再等 3 min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水並用吸水紙將水吸幹。

4. 按前麵方法配 4% 的濃縮膠, 加入 TEMED 後立即搖勻即可灌膠。將剩餘空間灌滿濃縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由於膠凝固時體積會收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固後,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

注意:「濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠」其實說經常有點過了,補 1~2 次就行了,不補膠問題也不大。

5. 用水衝洗一下濃縮膠,將其放入電泳槽中。

注意:衝洗的話個人感覺可以使用 5 ml 的針筒,當然操作不能太粗暴了。

6. 測完蛋白含量後,計算含 20-50μl 蛋白(注意:根據自己的實驗需要進行選擇,沒有固定的量)的溶液體積即為上樣量。

取出上樣樣品** 200μl 的 EP 管中,加入 5×SDS 上樣緩衝液**終濃度為 1×。(上樣總體積一般不超過 15μl,加樣孔的**大限度可加 20μ 樣品,其實大一點的垂直電泳槽每孔**大上樣量可以達到 40μl,膠做得很好的話 50μ 也是問題不大的)上樣前要將樣品於沸水中煮 5-10 min 使蛋白變性。

本人心得:可以使用 PCR 儀進行變性,加快速度,這樣就不用將水煮沸了,同時在水中煮蛋白樣品有下麵弊端:1.EP 管容易炸開,樣品丟失。2. 容易進水,使樣品體積增加,超過電泳**大上樣量。

7. 加足夠的電泳液後開始準備上樣。(電泳液**少要漫過內測的小玻璃板。)用微量進樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插**加樣孔中緩慢加入樣品。

注:加樣太快可使樣品衝出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電泳緩衝液中洗滌數次,以免交叉汙染

三、電泳

1. 電泳時間一般 4~5 h,電壓為 40 V 較好,也可用 60 V。

注:本人為了加快速度,濃縮膠時用 80-100 V 跑,到分離膠以後用 150-200 跑,結果也不錯,總時間 2 h 左右。

2. 電泳**溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進行轉膜。

注:如果目的條帶比較大的話,**好使用可視的蛋白 marker,Fermentas 的 0441 和 0671 比較好,就是有點貴。一般要讓目的條帶跑過分離膠的 1/3 比較好,不要局限於此說明。