操作篇:Western Blot 蛋白樣品製備

做 WB 之前,蛋白質的提取**關重要,成也提取敗也提取。現在開講;

一、單層貼壁細胞總蛋白的提取:

1.倒掉培養液,並將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸幹培養液(或將瓶直立放置一會兒使殘餘培養液流到瓶底然後再用移液器將其吸走)。

2.每瓶細胞加 3 ml 4℃ 預冷的 PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放輕輕搖動 1 min 洗滌細胞,然後棄去洗液。重複以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養液。將 PBS 棄淨後把培養瓶置於冰上。

3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF(100 mM),搖勻置於冰上。(PMSF 要搖勻**無結晶時才可與裂解液混合。)

4.每瓶細胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液,於冰上裂解 30 min,為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

5.裂解完後,用幹淨的刮棒將細胞刮於培養瓶的一側(動作要快),然後用槍將細胞碎片和裂解液移** 1.5 ml 離心管中。(整個操作盡量在冰上進行。)

6.於 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min。(提前開離心機預冷)

7.將離心後的上清分裝轉移倒 0.5 min 的離心管中放於-20℃ 保存。

(個人感覺上述方法可操作性有待加強,細胞中蛋白本來就很少,一瓶 50 ml 的細胞有時按照實驗要求隻能加 100-200μ 的裂解液,按照上述操作,直接用 200μ 裂解液進行裂解,根本就不夠瓶壁上沾的。本人是先用預冷的 PBS(一般數毫升)加入後,用細胞刮刮下細胞,轉移**試管中,如果數瓶細胞是收集同一蛋白的,可以放在同一試管,離心後再將蛋白轉移到 EP 管中,這樣可操作性就比較強)

二、組織中總蛋白的提取:

1.將少量組織塊置於 1~2 ml 勻漿器中球狀部位,用幹淨的剪刀將組織塊盡量剪碎。

2.加 400 μ 單去汙劑裂解液裂(含 PMSF)於勻漿器中進行勻漿。然後置於冰上。

3.幾分鍾後再碾一會兒再置於冰上,要重複碾幾次使組織盡量碾碎。

4.裂解 30 min 後,即可用移液器將裂解液移** 1.5 ml 離心管中,然後在 4℃ 下 12000rpm 離心 5 min,取上清分裝於 0.5 ml 離心管中並置於-20℃ 保存。

三、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取:

由於受藥物的影響,一些細胞脫落下來,所以除按(一)操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取:

1.將培養液倒** 15 ml 離心管中,於 2500rpm 離心 5 min。

2.棄上清,加入 4 ml PBS 並用槍輕輕吹打洗滌,然後 2500rpm 離心 5 min。棄上清後用 PBS 重複洗滌一次。

3.用槍洗幹上清後,加 100 μ 裂解液(含 PMSF)冰上裂解 30 min,裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

4.將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起 4℃.12000rpm 離心 5 min,取上清分裝於 0.5 ml 離心管中並置於-20℃ 保存。