操作篇:western blot 之蛋白含量測定

WB 實驗在提取完蛋白質後,就要對蛋白含量進行測定

測定方法如下:

一、製作標準曲線

1、從-20℃ 取出 1 mg/ml BSA,室溫融化後,備用。

2、取 18 個 1.5 ml 離心管,3 個一組,分別標記為 0 μg,2.5 μg,5.0 μg ,10.0 μg ,20.0 μg ,40.0 μg。

3、按下表在各管中加入各種試劑。

4、混勻後,室溫放置 2 min。在生物分光光度計上比色分析。

二、 檢測樣品蛋白含量

1、取足量的 1.5 ml 離心管,每管加入 4℃ 儲存的考馬斯亮藍溶液 1 ml。室溫放置 30 min 後即可用於測蛋白。

2、取一管考馬斯亮藍加 0.15mol/L NaCl 溶液 100 μl,混勻放置 2 分鍾可做為空白樣品,將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按 blank 測空白樣品。

3、棄空白樣品,用無水乙醇清洗比色杯 2 次(每次 0.5 ml),再用無菌水洗一次。

4、取一管考馬斯亮藍加 95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl 溶液和 5μ 待測蛋白樣品,混勻後靜置 2 min,倒入扣幹的比色杯中按 sample 鍵測樣品。

注意:每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗 2 次,無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測,這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是 5 μl 樣品含的蛋白量。

(上述方法隻是一家之言,可以自我變通)