WB 過程中常見問題及建議大匯總

Western **印跡(Western Blot)是將蛋白質轉移到膜上,然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白,可用相應抗體作為一抗進行檢測,對新基因的表達產物,可通過融合部分的抗體檢測。
 
WB 實驗中常會出現各種問題,迪申生物技術(上海)有限公司專注於生產**組化相關產品多年,對 WB 實驗有一定了解,今天跟各位同學一起分享下 WB 實驗中各種問題及應用對策。

          問題                             可能原因                       建議
電泳條帶成笑臉狀 膠不均勻冷切,中間冷卻不好,電泳係統溫度偏高 減少電壓減慢電泳速度,在冷室或者冰浴中進行電泳
電泳條帶成皺眉狀 可能是由於裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡,或者兩邊聚合不完全 調整裝置
拖尾 樣品溶解不好 樣品充分溶解混勻後上樣
紋理(縱向條紋) 樣品中含有不溶性顆粒 樣品充分攪拌混勻
條帶偏斜 電極不平衡或者加樣位置偏斜 調整電極和加樣
條帶兩邊擴散 加樣量過多 適當減少上樣量
Marker 變黑色 抗體和 Marker 蛋白反應 在 Marker 和 sample 之間空出一個孔不上樣
背景高 膜封閉不夠 延長封閉時間,選擇**適宜的抗體稀釋度
一抗稀釋度不適宜 對抗體進行滴度測試,選擇**適宜的抗體稀釋度
一抗孵育的溫度偏高 建議 4℃ 結合過夜
二抗濃度度過高 降低二抗濃度
二抗的非特異性背景 增加一個二抗對照,不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否是由於二抗所致。可選擇其它二抗(特異性更強的,隻針對重鏈)
二抗孵育時間過久 減少二抗孵育時間
選擇膜的問題 硝酸纖維素的背景會比 PVDF 膜低
膜在實驗過程中幹過 實驗過程中要注意保持膜的濕潤
檢測時曝光時間過長 注意曝光時間的縮短
洗膜不充分 增加洗膜的時間和次數
抗體和封閉蛋白有交叉反應 檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應性,選擇無交叉反應的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應
雜帶較多 目的蛋白有多個修飾位點(磷酸化位點,糖基化位點,乙酰化位點等),本身可以呈現多條帶 查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白試劑大小
目的蛋白有其他剪切本 查閱文獻或生物信息學分析可能性
樣品處理過程中目的蛋白發生降解 裂解液中加入蛋白酶抑製劑,樣品處理在冰上進行
上樣量過高,太敏感 適當減少上樣量
一抗不純 純化抗體
一抗特異性不高 重新選擇或製備高特異性的抗體
二抗的非特異性結合 增加一個二抗對照,不加一抗,其他操作過程不變,即可驗證背景是否是由於二抗所致。可選擇其它二抗(特異性更強的,隻針對重鏈)
一抗或二抗濃度偏高 降低抗體濃度
細胞傳代較多,導致蛋白變異 使用原代或傳代少的細胞作對照
蛋白條帶位置
(大小)不對
二聚體或多聚體存在 增加蛋白質變性過程及強度
翻譯後剪切 比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的,在執行功能時需要進行剪切成活化的形式
相對電荷 氨基酸電荷的組成
蛋白修飾 比如糖基化、磷酸化等修飾狀態會導致蛋白分子量增加
膠濃度 不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差
無蛋白條帶 抗體孵育不充分 增加抗體濃度,延長孵育時間
酶失活 直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 設置陽性對照,如果陽性對照有結果,但標本沒有則可能是標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標本上樣量解決靶蛋白含量低的原因
試劑之間不匹配 一抗與組織種屬,一抗與二抗或/和底物與酶係統之間不匹配。通過設置內參照可以驗證二級檢測係統的有效性
一抗失效 選擇在有效期內抗體,幷選擇現配現用的工作液
HRP 抑製劑 所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉
抗體不能識別測試種屬的相關蛋白 購買抗體前應認真閱讀抗體說明書,確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白
二抗與一抗不匹配 選擇針對一抗來源種屬的抗體
蛋白條帶信號弱 抗體孵育不充分 增加抗體濃度,延長孵育時間
酶活性降低 直接將酶和底物進行混合,如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物
洗膜過度 洗膜時間不宜過長,加入的去垢劑不宜過強或過多,建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20
標本中靶蛋白含量太低 增加樣本上樣量
抗體活性降低 選擇有效期內的抗體,工作液現配現用,避免長時間放置
蛋白轉移不充分 可以用麗春紅染膜幷結合染膠(考馬斯藍)後確定條帶是否轉移到膜上或轉移過度,適當調整轉膜的時間和電流
封閉過度 減少封閉劑的量或縮短時間,換用不同封閉劑類型
曝光時間過短 延長曝光時間
HRP 抑製劑 所用溶液和容器內避免含有疊氮化鈉
背景有黑色斑點 抗體與封閉試劑反應 使用前過濾封閉試劑
HRP 偶聯二抗中有聚集體 過濾二抗試劑,去除聚集體
暗背景上白色帶 HRP 含量過高 降低酶聯二抗的濃度
背景有不均勻的白色斑點 轉膜過程中有氣泡存在 仔細檢測,避免存在氣泡
抗體分布不均勻 孵育抗體時使用搖床