WB 轉膜條件推薦

Western **印跡(Western Blot)是將蛋白質轉移到膜上,然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白,可用相應抗體作為一抗進行檢測,對新基因的表達產物,可通過融合部分的抗體檢測。
 
為利於更好的實驗效果,不同蛋白,轉膜條件略有不同,今天跟各位同學一起分享下實驗過程中發現的不同蛋白的轉膜條件。
 
蛋白來源:RAW264.7 總蛋白
蛋白名稱:一些轉錄因子
蛋白分子量:40~70 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.45 NC
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 400 mA
轉膜時間:60~90 min
PS. 其實吧,以我的經驗來看,除非目的蛋白特別小,或者特別大,不然轉膜時間真的不是那麽重要, 曾經因為失誤,轉了 15 min 就拆下來了,但從麗春紅染色來看,跟平常實驗也沒有太大的區別。
 
蛋白來源:內皮細胞 總蛋白
蛋白名稱:occludin & AKT
蛋白分子量:65 KD & 56 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.45 PVDF
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒壓 100 V
轉膜時間:60~70 min
設備名字是「Bio-Rad mini」。
 
蛋白來源:**手術標本
蛋白名稱:轉錄因子
蛋白分子量:33 KDa
WB 用膜類型、孔徑:PVDF 膜
轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
轉膜時間:150 min
轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
說明:相同條件曾用於數個 30-70 KDa 的蛋白,都能成功轉上,不過沒有試縮短時間效果如何; 實驗時沒為轉膜條件苦惱,倒是電泳時膠的濃度及時間根據不同分子量而有區別。
 
蛋白來源:成纖維細胞
蛋白名稱:smad3
蛋白分子量:54 KDa
WB 用膜類型、孔徑:PVDF 膜
轉膜方式(恒壓、恒流):350 mA 恒流
轉膜時間:150 min
轉膜設備:濕轉 Bio-Rad 
蛋白來源:**細胞
蛋白名稱:磷酸化蛋白
蛋白分子量:10-200 KDa
WB 用膜類型、孔徑:millipore PVDF 膜 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):120 v 恒壓
轉膜時間:120 min
轉膜設備:濕轉 Bio-Rad
建議:轉膜緩衝液隻用 2 次,基本都轉上,5%BSA 封閉,減少背景。
 
蛋白來源:Hepg2
蛋白名稱:EGFR
蛋白分子量:170kd
WB 用膜類型、孔徑:pvdf 0.45
轉膜方式(恒壓、恒流):24V
轉膜時間:2 個半小時
轉膜設備:伯樂半幹轉
 
蛋白來源:肝癌細胞
蛋白名稱:HIF-1α
蛋白分子量:120 kD
WB 用膜類型、孔徑:NC 膜
轉膜方式(恒壓):80 伏,濕轉
轉膜時間:150 分鍾
設備:「Bio-Rad mini」
建 議:濕轉,轉膜液特別重要,否則會導致電壓或者電流不穩影響轉膜條帶。轉膜均現配先用,不重複利用。轉膜時間一般是 150 分鍾,80 伏恒壓。經李春紅染 色,靠近蛋白膠的一側膜上蛋白染色深,膜另外一麵染色淺,說明蛋白未轉過。該濕轉條件自己做過的蛋白分子量範圍:170-36 kD。
 
 
蛋白來源:肺髒
蛋白名稱:ICAM-1
蛋白分子量:85~110 KD
WB 用膜類型、孔徑:0.22NC
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 300 mA
轉膜時間:120 min
設備名字 Bio-Rad mini
一抗用的 santa cruz 1 mL 包裝的。 比例調整到 1:800 做出很好的條帶。 效價會一直降低的。去年做的這個指標,今年夏天做就不行了。
 
蛋白來源:人**細胞
蛋白名稱:磷酸化蛋白
蛋白分子量:30-60 KDa
WB 用膜類型、孔徑:pall NC 膜 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜
轉膜時間:60-90 min
轉膜設備: 北京六一 半幹轉
建議:轉膜緩衝液用新鮮配製的,可先配成 2 倍的母液,轉膜液的多少會影響電轉的效率,一般將吸水紙潤濕即可,不要和膜一起浸泡,這樣效果很好。
 
蛋白來源:人肝癌**細胞
蛋白名稱:notch
蛋白分子量:60-120 KDa
WB 用膜類型、孔徑:pall NC 膜 0.45 um
轉膜方式(恒壓、恒流):恒流 0.3 A
轉膜時間:-20 度冰櫃 120 min
轉膜設備: 濕轉 Bio-Rad
建議:轉膜緩衝液用新鮮配製的,可先配成 10 倍或 5 倍的母液,保持低溫是轉膜效果的一個保證,這樣效果很好。
 
蛋白來源:肺髒、肝髒等。
蛋白名稱:actin
蛋白分子量:43 kD
WB 用膜類型、孔徑:NC 膜 PALL 0.22 um
轉膜方式(恒壓、恒流):濕轉 恒流 200 mA
轉膜時間:45~60 min
設備名字 Bio-Rad mini
用的 santa cruz 分裝和整裝的都可以。效價一般 1:1000-1:3000 左右,可穩定較長一段時間。