WB 或 IP 樣品製備的技術指導

在 WB 和 IP 實驗中,破碎細胞或組織與選擇和配製裂解液一樣重要。比起一些更軟的組織(如腦組織),在準備 WB 或 IP 的樣品時,緊密的纖維組織(如肌肉組織)需要更劇烈的方法;對於培養的原代細胞或細胞係,在準備 WB 和 IP 的樣品時需要一定的機械攪拌去提取蛋白。機械破碎樣品常規的方法和設備如下:

組織高速勻漿儀

通常破碎體積大的植物或者動物組織需要用可旋轉、帶有刀片的勻漿儀或者攪拌器 .這些儀器通常通過一個電動的馬達帶動不鏽鋼可旋轉切割刀片,可以從頂部或者底部啟動,這個過程中產生很少熱量,但是樣品需要置於冰上。勻漿儀的轉速和刀片的尺寸,需要根據樣品的體積和組織大小來確定。大部分勻漿儀產生的顆粒較大,然而,一些帶特殊旋轉刀片的勻漿儀可以切割產生小到 4 微米且一致的顆粒,這種破碎對於一些小的單細胞樣本(如細菌、酵母)效果不明顯,但是對於大塊的、骨質的、纖維較多的樣本特別適用。

研缽和研磨勻漿器

研磨勻漿器特別適合軟組織和細胞懸液,它是由一個不鏽鋼或玻璃的活塞樣槌頭和一個玻璃槌管組成,勻漿器槌頭表麵和槌管壁是磨砂麵的,以提高研磨的效果。槌頭在管底部的縫隙通常是幾百微米,小的組織(通常被切割成 1 mm 的小段)放在槌管底部,同時加有預冷的少量裂解液,槌頭在勻漿槌管中旋轉可以使小的組織碎片粉碎。某些組織研磨相關儀器也會加入玻璃粉,氧化鋁珠或細沙去增強樣品的粉碎。

值得注意的是,在加入裂解液之前,一般陶瓷或者石製的研磨缽和冷凍過的研磨棒可以用來磨碎部分已經用液氮動過的固體組織。其他更進一步的組織粉碎的方法可以與冷凍研磨一起合用。

超聲破碎

超聲破碎一般是用超聲波的能量(大於 20 kHz)去破壞蛋白複合物、細胞器和細胞膜。超聲波的能量會產生很多微氣泡,這些氣泡可以內爆並產生衝擊波,也稱作氣穴作用。氣穴作用產生的機械壓力可以破壞細胞膜結構和蛋白複合物。超聲破碎是有效的切割染色質方法,可以有效提升樣品中蛋白質的可溶性,特別是完整的核蛋白和染色質相關蛋白的有效裂解都需要樣品的超聲處理。需要注意的是,盡管之前在樣品製備的過程中可能用其他的方法勻漿處理過,CST 仍然推薦補加超聲步驟處理所有樣品。

超聲的方法有兩種:直接法和間接法。直接法是超聲儀的探頭直接插入樣本中,而間接法是通過水浴這個介質將超聲波能量的傳遞到樣品管直至樣品內部,這兩種方法的優缺點如下:

1、直接(利用探頭)超聲

帶有探頭的超聲儀非常廣泛的用於小和中量樣本製備中。這種超聲儀的基本單元,通過電線與圓柱轉換器的連接產生高壓脈衝。轉換器把電能轉化成超聲波振動,這種超聲振動被放大,並通過實體的探頭傳遞到液體裂解樣品中。

有效超聲所需振動能量的優化(放大倍數/超聲強度)取決於樣本的體積和超聲探頭的大小。如果裂解液體積太小,探頭沒有足夠浸沒在液體中,或者探頭太大、超聲儀設置的頻率太高,樣本可能會在超聲過程中產生氣泡,影響超聲效果。

選擇合適的探頭也很重要,當液體的體積在 1-5 ml 之間, 很多超聲廠商推薦使用直徑為 3 mm 的探頭。如果用很小的探頭(小於 3 mm),並把探頭放於樣品較深的位置,將導致超聲破碎樣本效果大打折扣。

長時間的超聲過程產生的熱量會導致樣品變性或者降解。為了阻止樣本過熱,超聲過程中需要將樣品管放在冰浴中,每次超聲處理一段時間後需要在冰上暫停一段時間,用來減少熱量的產生,每次超聲的時間也可以優化。更多**的超聲儀可以設置時間、強度、暫停時間、重複超聲次數等參數並儲存為程序,以實現自動超聲。CST 隻用帶探頭的超聲儀去準備樣品,當處理 1 ml 的樣品時,用 3 mm 的探頭。ag娱乐app一般推薦使用 35%-40% 的**大功率進行 3 次超聲脈衝,每次超聲時間 10 秒, 每次超聲之間停頓 10 秒,不同的儀器可以調整**大功率水平在 200W 左右。

2、間接(水浴)超聲

水浴超聲的能量是通過水傳遞到樣品的內部,可以同時做多個樣品。因為不需要樣本與探針的匹配,因此樣本可以在無菌的條件下操作,避免探頭造成汙染,還可以避免樣本在超聲中過熱。這個方法比較適合高通量的實驗,或者小體積的樣本,因為體積小使用直接超聲會產生氣泡。間接超聲沒有直接超聲那麽有效,可以多做幾次間接超聲來提高樣品破碎的效果。當樣本數量不多時,直接超聲裂解還是很有效的。

3、用帶針頭的注射器進行破碎

如果沒有探頭超聲儀,可以用細的注射器針頭破碎樣本,也可以破環細胞膜並切割核染色質。針頭抽吸樣品產生的機械壓力,可以破碎細胞膜、細胞器和核蛋白複合物。**先,將樣本用裂解液重懸後,先用粗一些的針頭(如 10 ml 注射器針頭)進行多次吹吸,再換成更小的的針頭繼續吹吸,直到樣品粘稠度明顯下降,整個過程需要在冰上操作。