Western Blot詳解(原理、試劑、步驟及問題解答)

Western**印跡(Western Blot)是將蛋白質轉移到膜上,然後利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白,可用相應抗體作為一抗進行檢測,對新基因的表達產物,可通過融合部分的抗體檢測。
一、 原理
與 Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝 酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗 體起**反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋 白水平的表達。
二、分類
western顯色的方法主要有以下幾種:
i. 放射自顯影
ii. 底物化學發光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現 常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用**種方法,目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。隻要買現成的試劑盒就行, 操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。 
三、主要試劑
1、 丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺,應以溫熱(以利於溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配製含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亞甲雙丙 烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g,N,N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g,加H2O**100ml。)儲於棕色瓶,4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0,因可以發 生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月,隔幾個月須重新配製。如有沉澱,可以過濾。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O去離子水配製,室溫保存。
3、 分離膠緩衝液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。
4、 濃縮膠緩衝液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶於40mlH2O中,用約48ml 1mol/L HCL調**pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾後40C保存。這兩種緩衝液**使用Tris堿製備,再用HCL調節PH值,而不用 Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N,N,N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時,聚合反應受到抑製。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所**的自由基。去離子水配製數ml,臨用前配製.
6、 SDS-PAGE加樣緩衝液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩衝液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,巰基乙醇3.2ml,0.05%溴酚藍1.6ml,H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合,在沸水終煮3min混勻後再上樣,一般為20-25ul,總蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸電泳緩衝液:30.3gTris,188g甘氨酸,10gSDS,用蒸餾水溶解**1000ml,得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩衝液。臨用前稀釋10倍。
8、 轉移緩衝液:配製1L轉移緩衝液,需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS,並加入200ml甲醇,加水**總量1L。
9、 麗春紅染液儲存液:麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水**100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用後應予以廢棄。
10、 脫脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒,戴手套操作),溶於磷酸緩衝鹽溶液(PBS)。
12、 Tris緩衝鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 過氧化物酶標記的第二抗體。
15、 NBT(溶於70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。
16、 BCIP(溶於100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5),5mmol/L EDTA。
(可以參看分子克隆)
四、主要步驟
生物秀為您搜集了現階段幾乎網上所有的Western Blot的中英文資料,僅供實驗參考,可以根據自己實驗的實際情況進行調整:
Western Blot PROTOCOL:
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五、 實驗常見的問題指南
根據問題的類型主要分成以下幾類(以下資料權作參考,請勿盲目模仿!):

1. 參考書推薦
A. 對初學者看什麽資料比較好?
解答:《抗體技術實驗指南》和Antibodies(a laboratory manual, wrote by Ed Harlow ,david lane)兩本書不錯。

2. 針對樣品的常見問題
B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot (以下簡寫成Western Blot),提取線粒體後凍存(未加蛋白酶抑製劑),用的博士德的一抗,開始還有點痕跡,現在越來越差,上樣量已加到120μg,換了個santa cloz的一抗仍不行。是什麽原因?蛋白酶抑製劑單加PMSF行嗎?
解答:懷疑是樣品問題,可能是:1,樣品不能反複凍融;2,樣品未加蛋白酶抑製劑。同時,建議檢查Western Blot過程, 提高一抗濃度。對於加蛋白酶抑製劑來說,一般加PMSF就可以了,**好能多加幾中種蛋白酶抑製劑。
C. 細胞水平要做Western Blot,多少細胞提的蛋白夠Western Blot? 
解答:一般地5* 106就足夠了。
D. 同一樣品能同時提RNA又提蛋白嗎,這樣對Western Blot有無影響? 
解答:能,沒有問題,ag娱乐app做過。
E. 同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?
解答:當然可以,有的甚**可以同時測幾十種樣品。