磷酸化蛋白的western blot之建議

1.  一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑製劑,還要加入一定量的磷酸酶抑製劑,否則即使band壓出來也會很淺,結果也不可信。

2.  加一抗後**好4℃過夜,保證抗體有充分的結合時間。因為磷酸化的蛋白隻占總的蛋白量的極少部分。4℃也可使一抗重複使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時即可。

3.  磷酸化抗體的好壞是一個**因素,所以要選擇好的廠商。

4.  **好根據廠商的protocol來操作實驗,這是實驗成功的保證。

5.  抗體的稀釋倍數也要適當,不同廠商也會有不同要求。

6.  研究完某一蛋白的磷酸化情況後**好也要研究一下該蛋白總的表達量。如壓完phospho-p38抗體後,把相同的membrane做strip後再壓p38,然後再strip一次,再壓內標actin。

7.  做磷酸化蛋白WB時,除了目標蛋白的band以外,往往會出現非特異性的band。磷酸化抗體不好的話,甚**會壓出非特異性的band,而沒有你想要的band,所以壓片以後,你一定要根據markers比對一下,你壓出的band分子量是否正確。

8.  磷酸化蛋白WB時backgroud也往往較深,所以壓片時間要適當,不能太長或過短,太長則backgroud太深蓋住想要的那條band,時間過短則可能沒有band或者band太淺。

9.  磷酸化蛋白WB時,用TBST洗時也要注意一下,搖床的轉速不要太快,洗的時間不要太長,孵育一抗和二抗之後分別洗5 min 3次即可,寧願background深一些,總比做不出來強得多。另外,洗的時候,**好不要把幾張membrane疊在一起洗。

11.  研究完某一蛋白的磷酸化情況後**好也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法,一是:相同的sample在不同的well中上樣兩次(可在相同的gel上,也可在不同的gel),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚**還可跑另一個gel,壓內標。但是不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。

12.  Strip時一定要注意:membrane一定要完全泡在strip solution中(可用較硬的塑料膜封好),然後要完全浸入水中,使受熱均勻。這一點很重要,要不然,隨後壓出來的總蛋白也好,內標也好就會不均一,無法進行比較。