Western Blot 之問題分析(二)

1.  凝膠腫脹或卷曲
注意轉膜之前,切割下來的凝膠一定要在轉膜緩衝液中浸泡平衡5-10分鍾,要含有20%的甲醇。

2.  條帶歪斜、或漂移
因為轉膜儀使用時間太長,兩塊板之間的海綿由於長期使用變得很薄。當按照陰極-海棉-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿依次放好後兩塊板不能壓緊,因而在膠和膜之間可能存在潛在的間隙,電轉移時蛋白從膠和膜之間的空隙中流走,形成如圖所示的形狀。使用十幾張普通的草紙墊在兩塊海棉之間,條帶就可以變得非常的漂亮。
另外,轉膜時轉膜液一定要浸沒凝膠和膜,否則也可能出現上述情況。

3.  單個或多個白點
轉膜時在膜與膠之間有氣泡。做三明治時一定要逐層壓緊,趕盡氣泡。同時轉膜液要提前配置好,加好甲醇,保證轉膜前夜體內氣泡排淨。氣泡存在的局部會抵抗蛋白轉膜,降低轉膜效率。

4.  轉膜緩衝液過熱
緩衝液離子強度太低,或電壓及電流過高。按照上述方式配液,同時轉膜過程中注意降溫。我在冰水混合物中轉膜,效果很好。

5.  背景過高
(1)封閉不全,我用5%-10%的光明脫脂奶粉,效果還可以,現在做基本上沒什麽背景。如果你覺得不夠可以加點BS,1%吧。
(2)一抗或者是封閉液與膜蛋白的交叉反應。這種情況通常可以通過加入TWEEN-20或多次洗膜加以解決。如果問題不能解決,那麽降低一抗濃度,或更換封閉液種類可能解決。
(3)一抗二抗中某些不純的物質也可以造成背景。
(4)抗體濃度太高,或孵育時間太常都可能遇到這種情況。那麽可以適當降低一抗二抗的濃度,或是用提高溫度的方式來代替雜交時間的延長;另外,少量多次得洗膜效果要優於多量而長時間得洗膜效果。
(5)曝光時間的控製。通常ag娱乐app線曝光一分鍾試試,條帶清晰背景也強,可以縮短曝光時間,或者過一段時間等熒光減弱以後再發光,一般也可以發出比較好的條帶。如果背景強於條帶,那麽肯定是前麵默默個原因的一種,這是可以將膜在TBST中漂洗以下再發光,有時會有比較好的效果(僅限於**外較好的試劑盒,**產的不行,洗一下啥也沒了!)這個時候可以洗膜,洗膜後重新發光。

6.  沒有信號
(1)用單抗時比較容易出現這種情況。因為單抗主要是針對天然蛋白,這個時候,TWEEN-20的作用就顯現出來了,它可以增加抗原抗體複合物與膜的結合。
(2)確信你的蛋白表達。
(3)確信蛋白高效的轉移到你的膜上。
(4)一抗二抗的效價問題。無論哪個無效都不能發光,因此預實驗一定要從**低的稀釋度開始,以排除抗體的因素。
(5)ECL試劑盒質量的問題,不可小覷。偶親身經曆。碰到一批次品。兩個月白搭!

7.  微量進樣器堵了怎麽辦
**先從預防入手,每次用後的進樣器及時用蒸餾水清洗!
如果堵了,不要緊,有辦法:可以用如下辦法解決:
(1)**先反複推拉上樣針,看是否可將堵塞物吹出來;
(2)方法1不靈,若是25或50 ul 的針,把針從後側拔出,然後重新插入,使其內部產生氣壓,可能壓出堵塞物質;
(3)如上述方法不靈可以在拔出後注入些清水,然後重新插入,用水壓排出;
(4)**後的方法,**靈的方法:開始步驟同第3種方法中,在加入水後,將上樣器的前端針部放在酒精燈上煆燒**紅色(估計在什麽位置堵的),注意 燒紅部分不要距離玻璃過近,然後,趁熱突然推針,將水強行推出,通道打開後,再通過稀酸或稀堿衝洗即可!
(5)或者放在超聲清洗儀裏,超聲試試 
注意,切記在推拉過程中小心不要把針弄彎

8.  關於SDS蛋白電泳的一點心得 
(1)蛋白電泳中出現的縱向條帶:原因主要是由於電泳樣品或是電極緩衝液中有沒有溶解的樣品顆粒所致,上樣前充分將樣品離心,或重新使用新配電極緩衝液即可解決。
(2)電泳條帶前沿在染色脫色後呈尖形。原因是由於上樣量大且工作電壓過大引起,實驗中采用90/120,後來改用了80並且不換電壓;同時減少上樣量到原來的一半,得到了滿意的結果(樣品分子量18 000 Da,15%的分離膠);
(3)電泳結束後,染色脫色結果整個膠麵呈現藍色,背景很重 怎麽也脫不去,改用新配的電極緩衝液。問題解決,是電極緩衝液汙染的結果(壞毛病:喜歡在緩衝液中涮上樣針,導致緩衝液汙染 )。