如何監控轉膜的效率呢?

在早期,鄙人亦依據分子克隆的介紹,采用立春紅染膜。隻是後來發現此操作不僅增加額外的操作時間,而且不能說明任何問題,於是拋棄之。**先,立春紅(也包括考染膠)的靈敏

度和HRP-ECL體係的靈敏度相差太遠,即使立春紅染膜無顏色,也無法提示WB結果會不會失敗(考染膠無顏色也不能說明轉膜充分了,除非你銀染),你仍然得繼續後麵的操作;相反靶蛋白區域有顏色,亦無法提示靶蛋白就轉膜完全了,也許隻是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此,無論立春紅染膜失敗或成功,你都**進行後續的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時間,而且增加一輪漂洗的操作,對膜和膜上的蛋白都不好。那麽為什麽不采用更直觀的預染marker做轉膜監控的依據呢?理論上,同時轉膜、顏色是交聯到蛋白上的,因此顏色有多深表明有多少蛋白轉印到膜上,非常直觀、不會增加任何額外的操作(固定marker的上樣量非常必要)。當然上麵提到針對PVDF膜,由於對小分子截留的局限,顏料分子會在高強度的轉印過程中從交聯的蛋白上脫落並穿過膜(顏料與蛋白交聯得過深會使整個lane糊掉;太緊(多)可改變蛋白構象使遷移率改變。所以多數情況下顏料和蛋白之間是一種不穩定的交聯,這意味著在某些條件下,顏料會從交聯的蛋白上脫落,又因為膜分子孔徑以及膜對不同物質吸附能力的差異,顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙背麵,而蛋白則被牢固的截留在膜上),造成轉膜過度的假象。現在你知道有這種局限,要麽更換NC膜;要麽采用上麵提到的非常穩定的轉膜條件、注意必要的細節,就可從根本上忽略掉其對轉膜效率的指示,而把預染的marker僅僅作為一個分子量大小的指針,當然同時可確認之前的轉膜操作無誤(沒有插反電極,放反膜),也可為後續抗體孵育操作時膜的正反麵做必要的提示。

不同公司預染的marker效果不太相同,一般NEB和invitrogen的常規分子量預染marker要上8-10ul,MBI的隻要5ul(膠大小20×30cm),Biorad-mini3型(8.2×7.4cm)MBI**低2.5ul轉膜後就足夠清晰。