Western Blot轉膜

在電流的作用下,使蛋白質從膠轉移**固相載體(膜)上。

膜的選擇:印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。ag娱乐app選用PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附、物理強度,以及具有更好的化學兼容性。 有兩種規格:Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。

A 半幹法

即將凝膠夾層組合放在吸有轉印緩衝液的濾紙之間,通過濾紙上吸附的緩衝液傳導電流,起到轉移的效果。因為電流直接作用在膜膠上,所以其轉移條件比較嚴酷,但是其轉移時間短,效率高。

1 實驗條件的選擇

電流1mA-2mA/cm2,ag娱乐app通常100mA/膜,按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉移時間,具體可以根據實際適當調整。

目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉移時間

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10 1.5

15--40 12 0.75

<20 15 0.5

2 實驗操作

(1)濾紙和膜的準備 (在電泳結束前20分鍾應開始準備工作)。

A. 檢查是否有足夠的transfer buffer,沒有立即配製。

B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。

C. 將膜泡入甲醇中,約1-2分鍾。再轉入transfer buffer中。

D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。

PDVF膜在進轉移緩衝液時,要在甲醇裏麵泡多長時間?

PVDF是疏水性的,在轉膜緩衝液裏很難浸透,甲醇處理後使更容易浸潤。 PVDF的預處理是用甲醇浸泡活化,浸泡透之後轉入蒸餾水洗兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上麵的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合。

一般5-20分鍾都有人在用。可在取膠的同時泡,估計前後5分鍾左右。效果還不錯。以前有站友發貼,說處理時間沒多大關係,**看膜的質量.確實是這樣的。隻要讓膜完全浸透應該就沒問題了。

Hybond的PVDF說明書這樣的寫的:“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是,**少10秒鍾,多泡下也沒關係的,事實上,泡10秒的做過,10分鍾的也做過,都沒有問題的。

(2)轉移

A. 在電轉移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B. 將膜鋪在靠膜濾紙上,注意和濾紙間不要有氣泡,再倒一些transfer buffer到膜上,保持膜的濕潤。

C. 將膠剝出,去掉stack gel,小心的移到膜上。

D. 剪去膜的左上角,在膜上用鉛筆標記出膠的位置。

E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer,再鋪兩張靠膠濾紙。

F. 裝好電轉移儀,根據需要選定所需的電流和時間。

G. 轉移過程中要隨時觀察電壓的變化,如有異常應及時調整。

3 注意事項及常遇到的問題:

1)濾紙、膠、膜之間的大小,一般是濾紙>=膜>=膠。

2)濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡,氣泡會造成短路。

3)因為膜的疏水性,膜****先在甲醇中完全浸濕。而且在以後的操作中,膜也**隨時保持濕潤(幹膜法除外)。

4)濾紙可以重複利用,上層濾紙(靠膜)內吸附有很多轉移透過的蛋白質,所以上下濾紙一定不能弄混,在不能分辨的情況下,可以將靠膠濾紙換新的。

5)轉移時間一般為1.5 小時,( 1mA-2mA/cm2,10% gel),可根據分子量大小調整轉移時間和電流大小。

1)在疊膜、膠、紙三明治時候,操作於盛有轉膜Buffer的大平皿中進行,疊好後,再將三者平行轉移**轉膜裝置,切勿再移動,因為在buffer中操作,已經完全排除了氣泡存在的可能,無需再趕氣泡

2)關於轉膜時間:半幹轉的話,20 V×30min即可

B 濕法

ag娱乐app基本上不用此方法,這裏暫不做介紹。

C 轉移後效果的鑒定

1.染膠

用考馬斯亮蘭染色經destain脫色後,看膠上是否還有蛋白來反映轉移的效果。

2.染膜

有兩類染液選擇,可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等,這類染料染色後,色素可以被洗掉,膜可以用做進一步的分析用。但是不可逆的染料,如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等,染色後膜就不能用於進一步的分析。