western blot五年體會——“窮人的勞斯萊斯”

題記:本文轉載自丁香園論壇熱貼:“窮人的勞斯萊斯”,作者seagate分享了他在從2005年**次見到抗體到2010年間五年western blot的實驗經曆。五年裏,太多的磨難,太多的驚喜,太多的感觸,太多的代價,讓seagate對於western blot實驗有了獨到深刻的見識。因為論壇排版不佳,轉載全文**此,以饗各位網友。再次向丁香園網友seagate致以誠摯的謝意。

1、抗體的選擇

     對於**內的大多數實驗室來講,做western blot實驗選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單,買進口抗體捉襟見肘,買**產抗體得需要大無畏的勇氣,對於我所在的蘭州地區的實驗者而言,感觸尤深。在這五年的western blot實驗曆程裏,我先後用過進口抗體,進口抗體**內分裝包裝,**產抗體,質量良莠不齊。

     進口抗體一般不會出現閃失:abcam品種全,質量過硬,但價高(3400元/100微升),而且說是100微升,但**多能吸出來90微升;Sigma的價**貴;比較有性價比的是CST的抗體,現在好像是2200元/100微升,我前後用過二十幾種, 1:1000的稀釋比下,還沒有失過手,100微升通常能完成所有的**組化和western blot實驗,還有一個優點是通常量比100微升多出來10微升,**的不足是CST的品種實在不多。Santa的多克隆抗體質量可以,但是選用Santa的單抗還是有風險,估計這也是業界共識了吧。

     進口抗體**內分裝包裝我也用過不少,嗬嗬,畢竟是窮人(420元/100微升),大概好抗體的比例約為50%,如果能做出來,也存在一個問題,就是抗體大多隻能用一次。我曾經把Santa的原裝抗體和分裝抗體做過比對(抗體品種,貨號等完全一致),在都能做出來的前提下,原裝抗體能重複使用的次數要多出許多。具體原因我已經揣測了好幾年,不敢說出來,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整個賣,也會有所不同。揣測歸揣測,假如隻為了發論文畢業走人,可以考慮選用進口分裝的多克隆抗體。

     **產抗體比較知名的就幾家,但質量確實不敢恭維。western blot能做出來的確實不多,而且雜帶多,背景不幹淨。ag娱乐app周邊的實驗室大多買**產抗體做**組化,怎麽說呢,應付碩士論文夠了。

     我也幫別人自製過抗體,再用抗原親和純化。效價非常不錯,誇張的時候1:10000都能做出條帶,**的麻煩是兔子太騷(騷臭),不知道這是不是“兔女郎”名號的來由。如果讀書非常悠閑,老板又特別想擁有手工作坊的情況下,可以自己伺候折騰兔子來玩玩,剛開始的時候還是蠻有成就感的。隻是單憑抗原表達和製備多抗,是不是可以寫成論文畢業,估計因校而異了。

     2、Western Blot設備

     目前**好的垂直槽和轉移槽還是Biorad(伯樂),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四塊膠,但通常用不上,由此造成垂直緩衝液的浪費,而且MINI4用綠色塑料夾住玻璃板來組成內槽,容易漏液,塑料夾應該是有疲勞壽命的,估計日子一長,彈性就會改變,所以如果你們實驗室剛買了MINI4,趕緊用,遭殃的肯定是某一級的師弟師妹們。

     Biorad的一套係統得兩萬多,西部能玩得起伯樂的還真不多。好在咱中**人聰明,上海天能的外觀和構造和伯樂的MINI3幾乎一模一樣,而且可以通用,不帶ag娱乐app是5千多一套,挺好用的。**的不足是塑料壽命不如伯樂,膠架容易斷裂。不過仔細算算,三套天能也就是一套伯樂的價格,值了。北京六一的垂直槽很轉移槽很好用,但垂直槽配膠不方便,玻板太厚,散熱不好,但能用,六一的ag娱乐app(電源)還是很好用的。

     3、Western Blot實驗條件

     Western Blot實驗條件我基本是按ABCAM公司經典教材做的,按以下的網址下載下來就可以了(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf)。具體的試劑配方我是按寶生物試劑冊的附錄部分配製。丙烯酰胺和甲叉我是從北京華美買的德**biomol原裝貨,配出來的膠可以提在手裏玩,彈性非常好,價格比sigma的便宜許多,1公斤好像是480多人民幣,夠實驗室用好長時間,現在ag娱乐app實驗室做雙向電泳都用biomol的膠,很好用。Marker我現在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了,蘭州的代理是上海生工。

     要強調的是垂直電泳緩衝液千萬不能回收用,具體願因你隻需上網查查SDS-PAGE的原理就知道了。轉移電泳緩衝液可以回收再用兩次。

     轉膜我通常是快轉兩百200毫安/2小時,慢轉80毫安/12小時。快轉是一定得做冰水浴,就是把槽子泡在冰水混合液裏。

     封閉我通常用BD的脫脂奶粉,不歸,260元500克,也是從北京華美買的。

     ECL我用pierce的,500毫升1650元,比**產的還便宜好用。

     膠片是柯達的,以前用過樂凱的,不如柯達。

     我很少用麗春紅或考馬斯染膜或染膠,總覺得是脫褲子***的事。