聚合酶鏈式反應(PCR)

實驗方法原理
PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
 
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:

①模板DNA的變性:模板DNA經加熱**94℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;
 
②模板DNA與引物的退火(複性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降**55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
 
③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈。
 
重複循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留複製鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鍾, 2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
實驗材料
模板DNA
試劑、試劑盒
dNTP、Taq DNA聚合酶、蒸餾水、PCR緩衝液、引物、氯化鎂
儀器、耗材
PCR儀、移液槍、PCR板、薄壁管、離心管、離心管盒
實驗步驟

一、標準的PCR反應體係
 

10×擴增緩衝液     10 ul
 
4種dNTP混合物   各200 umol/L
 
引物            各10~100 pmol
 
模板DNA      0.1~2 ug
 
Taq DNA聚合酶    2.5 u
 
Mg2+       1.5 mmol/L
 
加雙或三蒸水**    100 ul
 
二、PCR引物設計

PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位於待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位於待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

1.   引物設計的基本原則

(1)  引物長度:15-30 bp,常用為20 bp左右。

(2) 引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC**好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

(3) 引物內部不應出現互補序列。
 
(4)兩個引物之間不應存在互補序列,尤其是避免3 ′端的互補重疊。
 
(5) 引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列,否則易導致非特異性擴增。
 
(6)引物3‘端的堿基,特別是**末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,**佳選擇是G和C。

(7) 引物的5 ′端可以修飾。如附加限製酶位點,引入突變位點,用生物素、熒光物質、地高辛標記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。

2.   引物設計軟件

Primer Premier5.0 (自動搜索)*、Oligo6 (引物評價)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在線服務)。

三、模板的製備

(1)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

(2)模板的取材主要依據PCR的擴增對象,可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。

(3)標本處理的基本要求是除去雜質,並部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌,可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗製DNA,經酚、氯仿抽提純化,再用乙醇沉澱後用作PCR反應模板。

四、PCR反應條件的控製

1.  PCR反應的緩衝液提供合適的酸堿度與某些離子 。 

2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L。
  
3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配製,20~200 umol/L。
 
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)。
  
5.  引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L。
 
6.  反應溫度

(1)變性溫度和時間95℃,30 s。

(2)退火溫度和時間 低於引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

(3)延伸溫度和時間72℃,1 min/kb(10 kb內)。

(4)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

7.  循環次數 :一般為25 ~30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低,可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數並不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右,循環數超過30個以後,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產物的量不再隨循環數的增加而增加,出現了所謂的“平台期”。

五、PCR的循環參數
 
1.  預變性(Initial denaturation)

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功**關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鍾。

2.  循環中的變性步驟

循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列完全變性,可能的情況下可 縮短該步驟時間,變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗。

3.  引物退火(Primer annealing)

退火溫度需要從多方麵去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進行(Taq酶**適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。

5.  循環數

大多數PCR含25-40循環,過多易產生非特異擴增。

6.  **後延伸

在**後一個循環後,反應在72℃維持5-15分鍾.使引物延伸完全,並使單鏈產物退火成雙鏈。

六、PCR步驟
 
1.  DNA變性

(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。

2.  退火

(25℃-65℃):係統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

3.  延伸

(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性**佳)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

七、PCR檢測
 
PCR反應擴增出了高的拷貝數,下一步檢測就成了**。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是**常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。
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注意事項
1.  由於PCR反應靈敏度很高,因此要特別主意防止DNA汙染的發生。樣品間的相互汙染可能產生假陽性結果,特別是將PCR技術應用到臨床病原菌感染確定中。
 
2.  如果是公用的、沒有密碼保護的PCR儀,經常檢查PCR儀上的程序正確與否。
 
3.  不使用過量試劑“less is usually better (more specific)”。
 
4.  試劑購回後應分裝成小份使用,這樣一旦有汙染發生,可以立即丟棄汙染的試劑,不會造成大的損失;試劑分裝也有助於減少反複凍融次數(例如dNTPs對反複凍融敏感)。
 
5.  加完所有試劑後用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。
 
6.  使用陰性對照檢查汙染的發生。
 
7.  使用陽性對照(能良好擴增的樣本)。
 
8.  電泳時使用DNA分子量標準品(指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照係統失敗)。
 
9.  當擴增很長的、GC含量高的模板時或容易產生二級結構的模板時適量使用添加劑(glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度;glycerol也可起到穩定聚合酶活性的作用;DMSO 減少二級結構的發生,並通過減弱非特異性引物結合的穩定性,提高反應的特異性)。
 
10.  不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶(避免反複凍融),每次取酶時都使用新的槍頭酶,酶使用後應立即放回冰箱。酶要在加完緩衝液後再加,直接將酶加入水中可能導致酶變性失活。

11.   PCR產物的電泳檢測時間,一般為48 h以內,有些**好於當日電泳檢測,大於48h後帶型不規則甚致消失。
 
 
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其他
一、  PCR反應的**環節

1.  模板核酸的製備。

2.  引物的質量與特異性。

3.  酶的質量。

4.  PCR循環條件。

二、 PCR常見問題及對策

1.  假陰性,不出現擴增條帶
 
(1)模板原因

①  模板中含有雜蛋白質。

②  模板中含有Taq酶抑製劑。

③  模板中蛋白質沒有消 化除淨,特別是染色體中的組蛋白。

④  在提取製備模板時丟失過多,或吸入酚。

⑤  模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配製有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。
 
(2)酶失活

①  需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。

②  忘加Taq酶或溴乙錠。
 
(3)引物

①  引物質量。

②  引物的濃度。

③  兩條引物的濃度是否對稱。

解決對策:

①  選定一個好的引物合成單 位。

②  引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。

③  引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。

④  引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。
 
(4)Mg2+濃度

①  濃度過高降低PCR擴增的特異性。

②  濃度過低影響PCR擴增產量甚**使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
 
(5)反應體積的改變

①  通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul,應用多大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定;

②  在做小體積如20 ul 後,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。
 
(6)物理原因
 
①  變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性。

②  退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率;退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。

③  擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度有問題。
 
(7)靶序列變異

①  靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合。

②  靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。

2.  假陽性,出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。
 
(1)引物設計不合適

①  選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性。

②  靶序列太短或引物太短。
 
(2)靶序列或擴增產物的交叉汙染

①  整個基因組或大片段的交叉汙染。

解決方案:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。

②  空氣中的小片段核酸汙染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拚接,與引物互補後,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生。

解決方案:可用巢式PCR方法來減輕或消除。
 
3.  出現非特異性擴增:PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。

(1)  引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體。

(2) Mg2+離子濃度過高。

(3) 退火溫度過低。
 
(4) PCR循環次數 過多有關。

(5) 酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。

其對策有:必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
 
4.  出現片狀拖帶或塗抹帶
 
(1)原因

①  酶量過多。

②  酶的質量差。

③  dNTP濃度過高。
 
④  Mg2+濃度過高。

⑤  退火溫度過低。

⑥  循環次數過多引起。

(2)對策

① 減少酶量。

②  調換另一來源的酶。

③  減少dNTP的濃度。

④  適當降低Mg2+濃度。

⑤  增加模板量。

⑥  減少循環次數。