蛋白質的表達、分離和純化

目的要求

(1)了解克隆基因表達的方法和意義。

(2)了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。

實驗原理

克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理,同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸杆菌是目前應用**廣泛的蛋白質表達係統,其表達外源基因產物的水平遠高於其它基因表達係統,表達的目的蛋白量甚**能超過細菌總蛋白量的80%。本實驗中,攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸杆菌BL21中,在 37℃,IPTG誘導下,超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯黴素酰基轉移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質加以提純,實為金屬熬合親和層析(MCAC)。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

試劑和器材

一、試劑

[1] LB液體培養基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸餾水配**1000mL.

[2] 氨苄青黴素:100mg/mL

[3] 上樣

緩衝液:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0

[4] Washing Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3

[5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0

[6] IPTG

二、器材

搖床,離心機,層析柱(1′10 cm)

操作方法

一、氯黴素酰基轉移酶重組蛋白的誘導

1. 接種含有重組氯黴素酰基轉移酶蛋白的大腸杆菌BL21菌株於5mL LB液體培養基中(含100ug/mL 氨苄青黴素),37℃震蕩培養過夜。

2. 轉接1mL過夜培養物於100mL(含100ug/mL 氨苄青黴素)LB液體培養基中,37℃震蕩培養**OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 樣品用於SDS-PAGE 分析。

3. 加入IPTG**終濃度0.5 mmol/l, 37℃繼續培養1-3h.

4. 12,000rpm 離心10 min, 棄上清,菌體沉澱保存於-20℃或-70℃冰箱中。

二、氯黴素酰基轉移酶重組蛋白的分離、純化

1. NTA層析柱的準備:在層析柱中加入1mL NTA介質,並分別用8mL 去離子水,8mL上樣緩衝液洗滌。

2. 重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉澱,加入5mL上樣緩衝液, 用吸管抽吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min, 4℃ 12000rpm 離心 30 min, 將上清吸**一個幹淨的容器中,並棄沉澱。取10ul 上清樣品用於SDS-PAGE 分析。

3. 上清樣品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10ul樣品用於SDS-PAGE 分析。

4. 洗脫雜蛋白:用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱,直**OD280 = 0.01.分步收集洗脫液,約3-4h,取10ul洗脫開始時的樣品用於SDS-PAGE 分析。

5. 洗脫目標蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 級分,分別取10ul樣品用於SDS-PAGE 分析。