使用DYCZ 24DN型迷你雙垂直ag娱乐app做SDS-PAGE

C.1 實驗試劑
(1) 1.5mol/L Tris‐HCl (pH8.8):取18.15g Tris, 加50ml 蒸餾水,緩慢的加濃鹽酸**pH8.8(約加3ml);讓溶液冷卻**室溫,pH 將會升高,加蒸餾水**100ml。
(2) 1mol/L Tris‐HCl (pH6.8):取12.1g Tris, 加50ml 蒸餾水,緩慢的加濃鹽酸**pH6.8(約加8ml);讓溶液冷卻**室溫,pH 將會升高,加蒸餾水**100ml。
(3) 10% (w/v) SDS: 取10g 的SDS,加蒸餾水**100ml。
(4) 20% (v/v) 甘油: 取20ml 100%甘油,加入50ml 蒸餾水。
(5) 1% (w/v) 溴酚藍:取100mg 溴酚藍,加蒸餾水**10ml,攪拌,直到完全溶解,過濾除去聚合的染料。
(6) 1 mol/L 的二硫蘇糖醇(DTT):用20 ml 0.01 mol/L 乙酸鈉溶液(pH5.2)溶解3.09 g DTT,分裝成1ml 小份貯存於‐20℃。
(7) 30%丙烯酰胺溶液(配製含29% (w/v) 丙烯酰胺和1% (w/v) 甲叉雙丙烯酰胺的溶液100ml)在通風櫃中操作,取29g 丙烯酰胺,1 g 甲叉雙丙烯酰胺,加蒸餾水**100ml,緩慢攪拌直**丙烯酰胺粉末完全溶解,用石蠟膜封口,可在4℃存放數月。
(8) 10%過硫酸銨:取0.5g 過硫酸銨,加入5ml 蒸餾水,可保存在密封的管內,於4℃存放數月。
(9) 電泳緩衝液:取 3g Tris,14.4g 甘氨酸,1g SDS,加蒸餾水**1L, pH 約為8.3, 也可配製成10×的儲備液,在室溫下長期保存。
(10) 1×樣品緩衝液:將50μl 1mol/L Tris‐HCl (pH6.8)、200μl 10% SDS、500μl 20%的甘油、200μl二硫蘇糖醇(DTT)、100μl 1%溴酚藍和50μl 的去離子水於1.5ml ppendorf 管中,混合混勻,可在4℃保存數周,或在‐20℃保存數月。
(11) 考馬斯亮藍染液:1.0g 考馬斯亮藍R‐250,加入450ml 甲醇,450ml 蒸餾水及100ml 冰醋酸即成。
(12) 考馬斯亮藍脫色液:將 100ml 甲醇,100ml 冰醋酸,800ml 蒸餾水混勻備用。

C.2 分離膠的灌製
(1) 組裝凝膠模具: 按照DYCZ‐24DN 型迷你雙垂直ag娱乐app使用說明書裝配好灌膠用的模具。
(2) 本凝膠係統采用 15%丙烯酰胺濃度,線性分離範圍為12‐43KD,對於DYCZ‐24DN 型凝膠係統,一次性倒兩塊板所需要的分離膠的量為約10ml。將30%丙烯酰胺溶液5.0ml、1.5mol/L
Tris‐HCl (pH8.8)2.5ml、10% (w/v) SDS 0.15ml 和去離子水2.3ml 在一個小燒杯中混合,丙烯酰胺是神經毒素,操作時**戴手套。加入過硫酸銨0.1ml 和TEMED(N,N,N’N’‐四甲基乙二胺)0.004ml後,輕輕攪拌使其混勻(過量氣泡的產生會幹擾聚合)。凝膠很快會聚合,操作要迅速。小心將凝膠溶液用吸管沿隔片緩慢加入模具內,這樣可以避免在凝膠內產生氣泡。
(3) 當加入適量的分離膠溶液時(對於小凝膠,凝膠液加**約距前玻璃板頂端1.5cm 或距梳子齒約0.5cm),輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層1mm~5mm 的異丙醇,這使凝膠表麵變得平整。當凝膠聚合後,在分離膠和水層之間將會出現一個清晰的界麵。
 
C.3 濃縮膠的灌製
(1) 本凝膠係統采用 5%丙烯酰胺濃度,對於DYCZ‐24DN 型凝膠係統,一次性倒兩塊板所需要的分離膠的量為約4ml。吸盡覆蓋在分離膠上的水後將30%丙烯酰胺溶液0.67ml、1mol/L Tris‐HCl(pH6.8) 0.5ml、10% (w/v) SDS 0.05ml 和去離子水2.7ml 在一個小燒杯中混合。加入過硫酸銨0.04 ml和TEMED 0.004ml,並輕輕攪拌使其混勻。
(2) 將濃縮膠溶液用吸管加**分離膠的上麵,直**凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。將梳子插入凝膠內,直**梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊。**確保梳子齒的末端沒有氣泡。將梳子稍微傾斜插入可以減少氣泡的產生。
(3) 凝膠聚合後,小心拔出梳子,不要將加樣孔撕裂。將凝膠放入電泳槽內,在內外電泳槽中加入電泳緩衝液,使凝膠的上下端均能浸泡在緩衝液中。
 
C.4 製備樣品和上樣
(1) 將蛋白質樣品與 1x 樣品緩衝液(10μl+10μl)在一個Eppendorf 管中混合。100℃加熱3min。10000 r/min 離心5min。
(2) 用微量注射器或 20μl 的移液槍將樣品15μl 加入樣品孔中。將蛋白質樣品加**樣品孔的底部。 **後在所有不用的樣品孔中加上等體積的加樣緩衝液。

C.5 電泳
(1) 將電極插頭與適當的電極相接。電流流向陽極。將電壓調**200V(保持恒壓;對於兩塊0.75mm 的膠來說,電流開始時為100mA,在電泳結束時應為60mA;對於兩塊1.5mm 的膠來說,開始時應為110mA,結束時應為80mA)。
(2) 對於兩塊 0.75mm 的凝膠,染料的前沿遷移**凝膠的底部約需30~40 分鍾(1.5mm 的凝膠則需40 min~50min)。關閉電源,從電極上拔掉電極插頭,取出凝膠玻璃板,小心移動兩玻璃板之間的隔片,將其插入兩塊玻璃板的一角。輕輕撬開玻璃板,凝膠便會貼在其中的一塊板上。
 
C.6 考馬斯亮藍染色
這種染色方法在單條電泳帶中蛋白質**小檢出量為0.1μg 的蛋白。通常可以根據所需要的敏感度來選擇是使用考馬斯亮藍染色或銀染色。
(1) 戴上手套避免將手指印留在電泳凝膠上,將凝膠移入一個小的盛有少量考馬斯亮藍(20ml 已經足夠)的容器內(小心不要將膠撕破)。或將玻璃板連同凝膠浸在染料中輕輕振蕩直**凝膠脫落。
(2) 對於 0.75mm 的凝膠,可在搖床上緩慢震蕩5 分鍾~l0 分鍾,對於1.5mm 的凝膠,則需10 分鍾~20 分鍾,在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口。棄去染液,將凝膠在水中漂洗數次。戴手套以避免將雙手染色。
(3) 加入考馬斯亮藍脫色液(約50ml),清晰的條帶很快會顯現出來,大部分凝膠脫色需要1h,使用過的脫色液則可用水衝洗掉。為了脫色完全,需數次更換脫色液並震蕩過夜。