高效毛細管電泳(HPCE)的基本原理

高效毛細管電泳(high performance capillaryelectrophoresis,HPCE)是近年來發展起來的一種分離、分析技術,它是凝膠電泳技術的發展,是高效液相色譜分析的補充。該技術可分析的成分小**有機離子、大**生物大分子如蛋白質、核酸等。可用於分析多種體液樣本如血清或血漿、尿、腦脊液及唾液等,HPLC分析高效、快速、微量。

電泳遷移
不同分子所帶電荷性質、多少不同,形狀、大小各異。一定電解質及PH的緩衝液或其它溶液內,受電場作用,樣本中各組分按一定速度遷移,從而形成電泳。
電泳遷移速度(v)可用下式表示:
v=uE
其中E為電場強度(E=V/L,V為電壓,L為毛細管總長度)。u為電泳淌度。

電滲遷移
電滲遷移指在電場作用下溶液相對於帶電管壁移動的現象。特殊結構的熔合矽毛細管管壁通常在水溶液中帶負電荷,在電壓作用下溶液整體向負極移動,形成電滲流。帶電微粒在毛細管內實際移動的速度為電泳流和電滲流的矢量和。

分離分析類型
根據其分離樣本的原理設計不同主要分為以下幾種類型:
①毛細管區帶電泳(capillary zoneelectrophoresis,CZE);
②毛細管等速電泳(capillarychromatography,CITP);
③毛細管膠速電動色譜(miceller electrokineticcapillary chromatography,MECC);
④毛細管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis,CGE);
⑤毛細管等電聚焦(capillary isoelectricfocusing ,CIEF)。

毛細管區帶電泳(CZE)為HPCE的基本操作模式,一般采用磷酸鹽或硼酸鹽緩衝液,實驗條件包括緩衝液濃度、pH值、電壓、溫度、改性劑(乙腈、甲醇等),用於對帶電物質(藥物、蛋白質、肽類等)分離分析,對於中性物質無法實現分離。毛細管膠束電動色譜(MECC)為一種基於膠束增溶和電動遷移的新型液體色譜,在緩衝液中加入離子型表麵活性劑作為膠束劑,利用溶質分子在水相和膠束相分配的差異進行分離,拓寬了CZE的應用範圍,適合於中性物質的分離,亦可區別手性化合物,可用於氨基酸、肽類、小分子物質、手性物質、藥物樣品及體液樣品的分析。毛細管等速電泳(CITP)采用先導電解質和後繼電解質,構成不連續緩衝體係,基於溶質的電泳淌度差異進行分離,常用於離子型物質(如有機酸),並因適用較大內徑的毛細管而可用於微製備,但本法空間分辨率較差。毛細管等電聚焦電泳(CIEF)用於具兼性離子的樣品(蛋白質、肽類),等電點僅差0.001可分離的物質。毛細管凝膠電泳(CGE)依據大分子物質的分子量大小進行分離,主要用於蛋白質、核苷酸片段的分離。此外,還有毛細管電色譜(CEC)及非水毛細管電泳(CNACE),用於水溶性差的物質和水中難進行反應的分析研究。目前CZE和MECC用得較多,本文以這兩種方法為例來說明HPLC的原理。

CZE的基本原理
HPLC選用的毛細管一般內徑約為50μm(20~200μm),外徑為375μm,有效長度為50cm(7~100cm)。毛細管兩端分別浸入兩分開的緩衝液中,同時兩緩衝液中分別插入連有高壓電源的電極,該電壓使得分析樣品沿毛細管遷移,當分離樣品通過檢測器時,可對樣品進行分析處理。HPLC進樣一般采用電動力學進樣(低電壓)或流體力學進樣(壓力或抽吸)兩種方式。在毛細管電泳係統中,帶電溶質在電場作用下發生定向遷移,其表觀遷移速度是溶質遷移速度與溶液電滲流速度的矢量和。所謂電滲是指在高電壓作用下,雙電層中的水合陰離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象;電泳是指在電解質溶液中,帶電粒子在電場作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象。溶質的遷移速度由其所帶電荷數和分子量大小決定,另外還受緩衝液的組成、性質、pH值等多種因素影響。帶正電荷的組份沿毛細管壁形成有機雙層向負極移動,帶負電荷的組分被分配**毛細管近中區域,在電場作用下向正極移動。與此同時,緩衝液的電滲流向負極移動,其作用超過電泳,**終導致帶正電荷、中性電荷、負電荷的組份依次通過檢測器。

MECC的基本原理
MECC是在CZE基礎上使用表麵活性劑來充當膠束相,以膠束增溶作為分配原理,溶質在水相、膠束相中的分配係數不同,在電場作用下,毛細管中溶液的電滲流和膠束的電泳,使膠束和水相有不同的遷移速度,同時待分離物質在水相和膠束相中被多次分配,在電滲流和這種分配過程的雙重作用下得以分離。MECC是電泳技術與色譜法的結合,適合同時分離分析中性和帶電的樣品分子。